微生物谷氨酰胺轉胺酶的表達及分子改造研究進展

劉松，張東旭，堵國成，陳堅

江南大學生物工程學院 工業生物技術教育部重點實驗室，無錫 214122

微生物谷氨酰胺轉胺酶的表達及分子改造研究進展

劉松，張東旭，堵國成，陳堅

江南大學生物工程學院 工業生物技術教育部重點實驗室，無錫 214122

微生物谷氨酰胺轉胺酶具有催化蛋白質和某些非蛋白物質交聯的功能，被廣泛應用于食品、醫藥及紡織等領域。為提高該酶的產量及建立相應的分子改造平臺，上世紀90年代日本味之素公司便開展了微生物谷氨酰胺轉胺酶重組菌構建的研究。目前，該酶已在多個表達系統中實現活性表達，部分重組菌較野生菌的產酶能力有顯著提高。近年來，谷氨酰胺轉胺酶的分子改造研究也取得了初步進展，酶的催化活力、熱穩定性及底物專一性得到提升。文中對上述研究中涉及的蛋白質表達及改造策略進行了簡要的總結及分析，并指出相關研究的發展趨勢。

鏈霉菌，谷氨酰胺轉胺酶，蛋白質表達，分子改造，蛋白質結構

TGase最初從動物[3]和植物組織[4]中提取，產量低，分離成本高。1989年，日本味之素公司首次在土壤中分離到 TGase生產菌株，茂原鏈輪絲菌Streptoverticillium mobaraense S-8112[5]。此后，研究者不斷分離到新的TGase生產株菌，包括拉達克輪絲菌 Streptoverticillium ladakanum[6]，吸水鏈霉菌Streptomyces hygroscopicus[7]，環狀芽胞桿菌Bacillus circulans[8]，枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis[9]等。與其他來源的TGase相比，微生物發酵生產的TGase具有非Ca2+依賴性的特點，且生產周期短，成本優勢明顯。目前，鏈霉菌TGase已廣泛用于食品工業，適量添加TGase可顯著改善各類食品蛋白質的功能性質和營養價值，應用范圍包括肉制品、水產品、乳制品、植物蛋白制品等[1]。此外，TGase在一些非食品工業領域也具有較大的應用前景，如組織工程、紡織工業及生物學研究等[2]。然而，依靠優勢菌種選育和過程優化[10-11]的傳統發酵技術對TGase產量的提高十分有限，遠不能滿足市場需求。

為進一步提高產量，日本味之素公司率先開展了 TGase重組菌構建的工作。隨后，德國Martin-Luther University、臺灣食品工業發展研究所、臺灣國立中興大學、中科院微生物研究所、華南理工大學及諾和諾德 (中國) 制藥有限公司等相關研究機構或企業相繼報道了重組TGase的制備策略。至此，鏈霉菌TGase已在大腸桿菌、酵母、鏈霉菌及谷氨酸棒桿菌等宿主中成功表達(表1)。其中，重組谷氨酸棒桿菌胞外TGase活力達到16.3 U/mL[12]，遠高于野生菌發酵產酶水平[10]。然而，特有的催化性能[1]及活化機制[13]使鏈霉菌TGase在異源宿主中的高效表達遇到諸多問題，如，低表達量、易形成包涵體及無催化活性等。本文對上述研究中涉及的蛋白質表達策略進行了簡要的分析，并總結了TGase分子改造研究的最新進展，旨在為微生物 TGase的后續研究及具有類似活化機制的功能蛋白或酶類[14]的表達與改造提供參考。

1 重組TGase表達

如圖2所示，鏈霉菌TGase是一種胞外酶，以無活性的酶原 (pro-TGase) 形式分泌，pro-TGase被切除N-端酶原區后，轉化成活性TGase[15]。在分泌過程中，金屬蛋白酶 (TAMEP) 及絲氨酸蛋白酶參與了TGase的活化[13,16]。鏈霉菌TGase基因的完整讀碼框由信號肽基因、酶原區基因及成熟酶基因組成[6,15,17-19]。基于此，TGase表達系統的構建圍繞TGase及pro-TGase的表達進行，歷經了TGase非活表達及活性表達兩個階段。

圖1 TGase催化反應[1]Fig. 1 The catalytic reactions mediated by TGase[1].

表1 鏈霉菌TGase在異源體系中的表達Table 1 Expression of Streptomyces TGase in heterogeneous system

圖2 鏈霉菌pro-TGase活化機制[13]Fig. 2 The mechanism of pro-TGase activation[13].

1.1 TGase的非活性表達

1.1.1 表達TGase成熟酶

表達TGase成熟酶基因是獲得重組TGase最直接的方法。在大腸桿菌中，N-端融合信號肽的TGase可分泌至周質空間，但是蛋白表達量極低，且比酶活力遠低于野生酶[20]。而換用強啟動子[21]、N-端融合表達增強序列[21]以及密碼子偏好性優化[22]雖可提高表達量，但TGase基本以包涵體形式存在。使用受嚴謹調控的T7啟動子仍無法解決TGase成熟酶在大腸桿菌中的可溶性問題[27]。令人意外的是，雖然TGase成熟酶在酵母中成功分泌至胞外，卻無法獲得催化活性[26]。因此，上述重組TGase需經過體外復性才能獲得催化活性。傳統的稀釋法復性得到的TGase比酶活力可達到野生酶的水平，總酶活力收率達到50%[34]。“雙梯度 (脲濃度與pH) 上柱復性”同樣可成功復性 TGase[27]。然而，蛋白復性的高成本不利于TGase工業規模的生產。

1.1.2 表達pro-TGase

與TGase成熟酶的表達不同，各鏈霉菌來源的pro-TGase均可在大腸桿菌中高效可溶表達[28,30]。采用葡萄糖流加策略進行重組菌的高密度發酵，pro-TGase產量顯著提高[31]。結果表明，TGase酶原區的存在可能提高了 TGase在大腸桿菌中的溶解性。同樣，pro-TGase亦可在鏈霉菌、酵母及棒桿菌中高效可溶表達。在變鉛青鏈霉菌 Streptomyces lividans 66中，pro-TGase在自身啟動子及信號肽介導下即可高效分泌[23]。以酵母或棒桿菌為宿主時，pro-TGase則需在N-端融合宿主信號肽才能被分泌至胞外[26,29]。強化pro-TGase分泌的策略有2種：1) 修飾 pro-TGase酶原區；2) 優化信號肽與宿主菌的組合。前者可使pro-TGase分泌量提高25%[12]，后者得到的胞外pro-TGase可達到2 500 mg/L，是目前報道的最高水平[29]。

Pro-TGase表達后需經切除酶原區后才能轉化成活性TGase。用于pro-TGase活化的蛋白酶可從產TGase的野生菌 (如 Sv. mobaraense分泌的TAMEP[35]) 或其他鏈霉菌 (如白淺灰鏈霉菌Streptomyces albogriseolus分泌的 SAM-P20、SAM-P26及 SAM-P45等[23]) 中提取。一些商品化的蛋白酶亦能活化pro-TGase，如中性蛋白酶及胰蛋白酶等[36]。然而，活化反應體系中殘存的蛋白酶活力可能持續降解活性TGase，不利于其保存和應用[36]。為消除蛋白酶存留的不利影響，采用“上柱激活”的方法可將殘余的活化蛋白酶與TGase分離，TGase貯存穩定性顯著提高[31]。

1.2 TGase的活性表達

1.2.1 選擇適宜的宿主

在多數表達宿主中，TGase需要其酶原的輔助才能高效可溶表達。然而，特定的宿主環境似乎可以消除 TGase對酶原區的這種依賴。最新的報道表明，在肉桂鏈輪絲菌 Streptoverticillium cinnamoneum磷脂酶D (PLD) 啟動子及其信號肽的介導下 Sv. cinnamoneum TGase成熟酶基因可在 S. lividans 1326中高效表達 (230 mg/L)，產物分泌至胞外且比酶活力與野生酶相當[33]。

選用分泌活化蛋白酶的宿主表達 pro-TGase是直接生產活TGase的另一種方式。已發現具有TGase活化蛋白酶的宿主主要是鏈霉菌，包括 S. lividans3113[19]及 S. lividans JT46[6]。其中，以 S. lividans JT46為表達宿主時，TGase的活性表達較為成功。Sv. ladakanum[6]及平板鏈霉菌 Streptomyces platensis[18]來源的 pro-TGase在其內源啟動子及信號肽的作用下均可分泌至胞外；前者只有部分轉化為活性 TGase (1.46 U/mL) 而后者則完全活化(2.2 U/mL)。活化效率的差異可能是由于pro-TGase氨基酸序列不同導致的，后者的酶原區切割位點可能更易于被宿主蛋白酶所識別。因此，在酶原區與TGase成熟之間引入宿主蛋白酶特異性切割位點有望提高活性TGase的產量。事實上，在酶原區C-端加入酵母 Kex2肽鏈內切酶識別位點后，pro-TGase在酵母中表達后可直接轉化成活性 TGase[26]。值得注意的是，將 pro-TGase克隆至原始菌株中表達，借助其野生活化系統進行活化是一種提高TGase產量的有效方式[17]。

1.2.2 共表達活化蛋白酶

與其他表達策略相比，在無活化蛋白酶的宿主中共表達 pro-TGase及其活化蛋白酶得到活性TGase產量最高。在谷氨酸棒桿菌中共表達分別融合分泌信號肽的SAM-P45及pro-TGase，大量活性TGase即可分泌至胞外[24]；改造酶原區C-端后，該體系即可得到帶有天然N-端的TGase[25]。此外，共表達人鼻病毒3C蛋白酶及加入3C蛋白酶識別位點的 pro-TGase同樣可在大腸桿菌中直接得到活性TGase[32]。然而，共表達體系產生的活化蛋白酶存在持續降解活性TGase的可能[24]，同時蛋白酶活力對TGase產品的應用也將造成不利影響。

1.2.3 共表達酶原區

如前所述，在表達過程中酶原區對TGase的可溶性及催化活性有輔助作用。這種輔助作用可通過分子內相互作用來完成，即表達pro-TGase；也可通過分子間相互作用實現，即共表達酶原區與 TGase成熟酶。共表達酶原區與TGase成熟酶的一個重要優勢是無需活化蛋白酶參與即可得到活性 TGase，可避免共表達活化蛋白酶的不利影響。到目前為止，該策略只在酵母系統中成功實施[26]。

2 TGase分子改造

基因水平上的分子改造需要易于操作的蛋白表達系統及準確可行的檢測方法。應用于TGase分子改造的表達系統主要是大腸桿菌[28,32]及谷氨酸棒桿菌系統[37]。適于突變體篩選的TGase活力檢測方法包括三肽為底物的顯色法[37]、可定量檢測大分子交聯反應的基于酶標技術 (ELT) 的核磁共振法[38]及鄰近閃爍分析法 (SPA) 等[32]。此外，應用反向HPLC檢測蛋白濃度的技術為TGase比酶活力分析提供了快速可靠的方法[37]。目前，分子改造主要以茂原鏈霉菌Streptomyces mobaraensis (即Sv. mobaraense)來源的TGase為研究對象。

2.1 理性設計

2.1.1 基于分子柔性區域分析的定點突變

異核單量子相干譜 (HSQC) 可檢測酶分子中特定區域氨基酸缺失或突變對催化活性中心構象的影響；若缺失或突變未導致酶分子錯誤折疊但改變了催化活性中心的構象，則表明該區域具有一定的柔韌性，可作為分子改造的目標區域[39]。研究發現，N-端缺失第一個氨基酸 (Asp) 的 TGase (Ser-TGase) 較野生酶具有更高的催化活力[38]。基于此，通過HSQC確定N-端是TGase的一個柔性區域。實驗表明，適度缺失及取代突變N-端氨基酸殘基均可提高TGase的催化活性[39]。該方法可對晶體結構未知的酶分子進行理性改造，但柔性區域的檢測仍具有偶然性，需要一定的前期研究基礎。

2.1.2 基于水接觸表面熱點區域的定點突變(WASH-ROM)

WASH-ROM 認為，酶分子中具有高溶劑觸表面積 (SAS) 且與催化活性中心臨近的氨基酸殘基可能影響酶與底物的接觸，通過突變這些氨基酸可強化酶與底物的接觸，從而提高其催化活性[37]。在TGase分子的改造過程中，利用生物信息學軟件，如Discovery Studio (Accelrys Software Inc.)，計算出離TGase催化活性中心15?以內的90個氨基酸殘基的相對SAS，選取其中40個具有高相對SAS的氨基酸殘基分別進行1~6種氨基酸的單點取代[37]，得到的突變體最高比酶活力達到41.7 U/mg，是野生TGase比活力的1.5倍。該改造策略較前者更高效，但必須已知酶分子的晶體結構。

2.2 定向進化

理性設計改造TGase的突變體篩選工作量少，但其理論依據仍然有限。隨機突變的篩選工作量大，但可以對TGase多方面的催化性能進行改造，如熱穩定性、熱敏性及催化活力等。定向進化改造TGase的關鍵是建立突變庫高通量篩選方法。以大腸桿菌表達體系為篩選平臺時，細胞破碎、TGase的活化及酶活力檢測均在多孔板上完成[40]。通過隨機突變，正突變體的熱穩定性達到野生TGase的2.7倍，而熱敏性突變體則只保留了10 ℃~40 ℃間的催化活性[40]。以谷氨酸棒桿菌為篩選平臺時，TGase突變體基本分泌至胞外，無需細胞破碎及 TGase活化即可在多孔板上完成活性的篩選，工作效率顯著提高；所得 TGase正突變體最高比活力達到42.9 U/mg，是野生酶的1.7倍[37]。

2.3 理性設計與定向進化的結合

理性設計與隨機突變結合的基本思想是，根據已知數據和知識選擇酶分子特定區域進行隨機突變，在不影響突變效果的前提下降低突變庫的規模，可顯著提高分子改造的效率。改造TGase底物專一性的同時，發現N-端帶有額外Gly及Pro的TGase (Gly-Pro-TGase) 對人類生長因子 Gln141催化作用較野生TGase具有更高的專一性[32]；晶體結構分析表明Tyr62及Tyr75可能影響TGase的催化活力，且兩者的取代突變 (Tyr62His及 Tyr75Phe) 可提高TGase對 Gln141的專一性。基于此，對 Gly-Pro-TGase中Tyr62及Tyr75分別進行17種及12種氨基酸取代，構建飽和突變庫，最終篩選得到5個TGase突變體對Gln141具有高度專一性[32]。

2.4 TGase的結構與功能

晶體結構顯示 (圖3)，S. mobaraense TGase的二級結構屬于α+β型，含11個α-螺旋及8個β-折疊；分子總體呈盤狀并帶有一個裂縫，兩個loop環(Asp1-Ala10與Asn276-Met288) 組成裂縫左壁，一個loop環 (Asn239至Asn253) 組成裂縫右壁；催化活性基團Cys64、Asp255及His274均位于分子裂縫底部[41]。隨著分子改造研究的推進，TGase分子中影響酶學性質的重要結構區域得到初步揭示，包括：

1) 分子裂縫的左壁區域。該區域中N-端 loop環的修飾對 TGase催化性質有較大影響。適度缺失 N-端氨基酸殘基 (1~3個) 可提高 TGase的催化效率[39]。這可能是由于氨基酸的缺失降低了底物與催化活性中心接觸的空間位阻。N-端緊靠裂縫的氨基酸取代 (Ser2Arg等)[39]及位于分子表面的極性氨基酸取代 (Ala10Ser等)[37]或酸性氨基酸取代(如，Glu28Asp等)[37]均可提高TGase的催化活性。此外，N-端的單點突變還可提高 (Ser2Phe等) 或降低 (Pro9Leu等) TGase的熱穩定性[40]。

2) 分子表面與裂縫臨近區域。該區域包括盤狀分子的正面及背面。分子正面 (Gln74Ala等) 及背面 (Ser299Phe等) 的疏水性氨基酸取代突變提高了TGase催化活性[37]。而位于分子正面與裂縫臨近的Tyr62及Tyr75的取代突變還可顯著提高TGase的底物專一性[32]。

圖3 S. mobaraense TGase晶體結構 (正面)[41]Fig. 3 Crystal structure of S. mobaraense TGase (front view)[41].

3) 分子內部與催化活性基團臨近的區域。與催化活性基團 Asp25臨近的Gly257Ser與 Lys269Glu可增強TGase的熱穩定性[40]。分子內部的疏水性氨基酸取代 (Tyr42Phe及Ser199Ala) 對催化活性也有較大影響[37]。值得注意的是，N-端若添加Phe-Arg-Ala-Pro使 Ser199Ala的催化活性進一步提高[37]，體現了在酶活力調節過程中該區域與N-端區域的協同效應。突變體的晶體結構分析將有助于解釋這種效應。

最近，分子對接實驗 (Molecular docking) 已模擬出TGase與底物的結合方式[42]。合成小分子底物CBZ-Gln-Gly在TGase分子裂縫中被拉伸，活性位點通過疏水相互作用與底物結合；當TGase與大分子底物 (酪蛋白等) 結合時，TGase的底物識別位點將在分子裂縫表面進一步擴展，體現了微生物TGase對底物的適應性。總之，對TGase結構與功能的深入了解將有助于探測分子改造的靶點，提高改造效率。

3 總結與展望

大量的研究表明，鏈霉菌TGase在多數異源宿主中高效可溶表達需要其酶原區的輔助，這種輔助作用的本質是對TGase折疊進行不同性質的抑制。在大腸桿菌系統中，酶原區抑制TGase無序折疊產生包涵體；在酵母表達體系中，抑制TGase錯誤折疊產生無活性蛋白；在棒桿菌中，酶原區則抑制TGase快速折疊從而促進其分泌。最近 pro-TGase的晶體結構[43]已經公布，為進一步分析酶原區的功能提供了結構基礎。在已有的表達策略中，共表達TGase成熟酶及其酶原區較其他表達策略具有明顯優勢，是實現重組TGase工業規模生產的重要途徑。在某些宿主中TGase無需酶原區亦可高效分泌，因此，篩選可直接分泌表達TGase成熟基因的宿主及信號肽同樣應受到重視。

目前，微生物TGase分子改造的研究大部分以提高TGase的催化效率及熱穩定性為目標，對其底物專一性的改造則關注較少。事實上，微生物TGase對底物具有較高的專一性。底物篩選實驗表明，底物中谷氨酰胺殘基的臨近氨基酸組成[44-45]以及伯胺的鏈長[46-47]均對微生物 TGase催化反應有重要影響。隨著微生物TGase應用領域的擴展，底物分子的多樣性與TGase底物專一性的矛盾將日漸突出。因此，將來一個時期，在提高TGase環境穩定性的同時，應更加注重對TGase底物專一性的改造。近年來，理性設計與定向進化相結合的分子改造技術不斷發展，如重復飽和突變 (ISM) 及組合活性位點飽和突變 (CASTing) 等[48]，將為TGase的改造提供有力工具。

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Progress in expression and molecular modification of microbial transglutaminase

Song Liu, Dongxu Zhang, Guocheng Du, and Jian Chen
Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China

Microbial transglutaminase, which could catalyze the cross-linking of many proteins or non-protein materials, has been widely used in food, pharmaceutical and textile industry. To enhance the yield of the enzyme and establish corresponding platform for molecular modification, the researchers of Japanese Ajinomoto began to construct the recombinant strain producing transglutaminase in the 1990s. So far, the enzyme has been successfully expressed in different expression systems. Some of the recombinant strains are more productive than wild strains. Recently, progress has been made in the molecular modification of microbial transglutaminase, and the activity, thermo-stability and specificity of the enzyme are improved. This review briefly summarized and analyzed the strategies involved in these studies, and noted its trends.

Streptomyces, transglutaminase, protein expression, molecular modification, protein structure

谷氨酰胺轉胺酶 (Transglutaminase，EC 2.3.2.13， TGase)，能夠催化蛋白質肽鏈中谷氨酰胺殘基的 γ-羧酰胺基與各種酰基受體發生酰胺基轉移反應，形成 ε-(γ-谷氨酰基) 賴氨酸共價鍵。根據酰基受體不同，TGase催化反應分3類：1) 交聯反應：當蛋白質中賴氨酸殘基的ε-氨基作為酰基受體時，催化形成的ε-(γ-谷氨酰基) 賴氨酸共價鍵導致蛋白質分子內或分子間發生交聯，形成網絡結構 (圖1a)；2) 連接反應：當伯胺作為酰基受體時，催化形成的 ε-(γ-谷氨酰基)賴氨酸共價鍵使游離的伯胺與蛋白質連接 (圖1b)；3)脫酰胺：當不存在伯胺時，水成為酰基受體，TGase催化蛋白質中谷氨酰胺殘基的γ-羧酰胺基脫去氨基生成谷氨酸殘基 (圖1c)[1-2]。

May 4, 2011; Accepted: September 16, 2011

Supported by:National Natural Science Foundation of China (Nos. 31000031, 31171639), National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2011AA100905), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (No. BK2010147).

Guocheng Du. Tel/Fax: +86-510-85918309; E-mail: gcdu@jiangnan.edu.cn

國家自然科學基金 (Nos. 31000031, 31171639)，國家高技術研究發展計劃 (863計劃) (No. 2011AA100905)，江蘇省自然科學基金 (No. BK2010147) 資助。