惡性腫瘤患者循環DNA的研究進展

倪培民,孫 然,王 雷,劉 鐵,叢憲玲*

(1.吉林大學藥學院,吉林長春130021;2.吉林大學中日聯誼醫院組織標本庫)

*通訊作者

目前,對于惡性腫瘤,缺乏一種行之有效的早期診斷手段。絕大多數的惡性腫瘤明確診斷時已經是中晚期,經治療后患者五年生存率極低[1],并且預后極易復發。所以建立一種方便、微創、靈敏、特異的惡性腫瘤早期診斷手段勢在必行,循環DNA極易獲得,在惡性腫瘤發生的早期其含量和基因的異常改變就可以被檢測到[2],有望發展成為惡性腫瘤早期診斷的有效手段。

1 循環DNA的來源

循環DNA是一種存在于血漿或血清、腦脊液及滑膜液等體液中的細胞外DNA。腫瘤患者外周血中存在的循環DNA,含量明顯高出健康人水平,并且這些循環DNA具有腫瘤特征性。定量或定性分析這些循環DNA對腫瘤的早期診斷、治療及預后的評價都具有重要意義。

早在1947年Mandcl和Metals就發現了循環核酸,30年后Leon[3]等人的研究發現腫瘤患者血液循環中循環DNA的水平顯著高于正常人。健康人外周血游離DNA大多來源于血細胞,而腫瘤患者的外周血游離DNA主要來源于腫瘤細胞。通過近年的研究,人們推測腫瘤患者循環血中存在著的大量DNA可能來源于以下一些途徑[4]:(1)循環血或微轉移灶中腫瘤細胞溶解;(2)腫瘤細胞的壞死或凋亡;(3)腫瘤細胞不斷釋放DNA進入血液循環;(4)腫瘤侵襲致周圍細胞、組織變性而釋放DNA入血;(5)淋巴細胞與腫瘤細胞的相互作用。由此可見,腫瘤患者循環DNA的形成是多種途徑共同作用的結果。Domirguez等[5]分別檢測同一組患者的血細胞、腫瘤組織和血漿中DNA變異,27例膀胱癌患者中17例檢出血漿DNA與腫瘤組織DNA發生相同的改變。Szymanska等[6]檢測的29例肝細胞癌患者血漿與腫瘤DNA變異一致性達88.5%,這些都說明了外周血循環DNA主要來自腫瘤細胞。

2 循環DNA的定量檢測

有很多文獻都有對DNA定量的研究,但是對于DNA的定量檢測一直沒有一個統一的標準,以前是加入一些顯色劑,使之發生顯色反應,然后根據顏色改變的程度與濃度的一一對應關系,檢測其濃度,這種方法的特異性和敏感性非常低,限制了它們的應用。其它的分析方法,如血清凝集素抑制、補體結合等,在特異性上可能有所提高,但在敏感性上沒有進一步的改善。近年來,隨著DNA-RNA雜交技術、放射免疫分析法、對流免疫電泳技術的發展,納克級(ng)的DNA可以被檢測[7]。現在,實時定量PCR技術(Real-Time PCR)可以檢測皮克(pg)級的DNA。當然也有一些改進技術或聯合應用技術可以更加精確地測定循環DNA的含量。

趙文君[8]等對44例食管癌患者及100例健康對照的外周血,采用雙重實時熒光定量PCR檢測血漿DNA含量,結果發現食管癌患者血漿DNA含量顯著高于健康對照(P＜0.001)。Ⅱa期、Ⅱb期和Ⅲ-Ⅳ期患者血漿DNA含量分別為37.0 ng/ml、53.0 ng/ml和66.3 ng/ml。 Ⅲ-Ⅳ期明顯高于Ⅱa-Ⅱb期(P=0.003)。Ⅱa和Ⅱb期的血漿 DNA含量顯著高于健康對照組(P＜0.001)。高、中分化組和低分化組的血漿DNA含量分別為 32.3 ng/ml、52.9 ng/ml和 65.0 ng/ml,低分化組顯著高于高、中分化組(P=0.010)。潘世揚等[9]采用多重實時PCR技術對78例肺癌患者的血漿APC基因甲基化進行定量分析,其中的19例肺癌患者血漿中APC基因啟動子甲基化陽性,APC甲基化濃度為1.67×102-6.78×103拷貝/mL,中位濃度為1.60×103拷貝/mL。38例組織陰性的肺癌患者、31例肺部良性疾病患者和23例健康者的血漿APC基因啟動子甲基化均為陰性。

這表明在腫瘤患者中存在循環DNA水平的升高和甲基化異常現象,循環DNA可能成為腫瘤診斷的生物學標志,可能與腫瘤的臨床分期和腫瘤分化程度存在相關性;實時定量PCR技術由于其高精度已成為現在檢測循環DNA的主流技術。

3 循環DNA的定性分析

循環DNA和人類基因組DNA在核苷酸及堿基組成上是基本一致的,至少有47%的循環DNA堿基序列存在于人類基因組DNA中。已有很多研究表明循環DNA的基因改變與腫瘤組織DNA有較高的一致性[10-11]。目前循環DNA的定性分析包括:基因突變、甲基化異常、微衛星不穩定、雜合性缺失檢測等。

3.1 循環DNA的基因突變

K-ras基因是p21蛋白質的編碼基因,是人類腫瘤中最常見活化的原癌基因之一,在多種腫瘤中存在點突變,突變熱點主要有三個,即密碼子12、13、和61,尤其是12,這種異常尤以胰腺癌、結腸癌等發生率較高[12-13]。MuLcahy等[14]應用RFLP-PCR法檢測了21例胰腺癌患者的循環DNA,結果有17例患者的循環DNA中有K-ras基因突變,其中有4例循環DNA中有K-ras基因突變的患者最初診斷為胰腺炎,在此后的5-14個月中相繼被診斷為胰腺癌。

腫瘤抑制基因p53是迄今為止在人類癌癥中最常突變的基因,且突變范圍廣,其功能缺失可導致細胞基因組不穩定并誘發腫瘤,也可阻斷主要的凋亡途徑。研究顯示在結直腸癌、肺癌、肝癌、乳腺癌和頭頸部癌患者血漿/血清DNA中檢測到p53的點突變[15-16]。

3.2 循環DNA甲基化異常

DNA的甲基化是指生物體在 DNA甲基轉移酶(DNA mothyltransferase,D MT)的催化下,以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)為甲基供體,將甲基轉移到特定堿基上去的過程。DNA甲基化是人類重要的表觀遺傳學修飾,它可以調控基因的表達[19],由于甲基化的異常變化早于腫瘤的惡性增生[20],它的檢測對腫瘤的早期診斷有重要意義。AnQ等[21]報道在所研究的105例非小細胞肺癌患者中,73.3%的血樣中和79.3%的腫瘤樣中,p16基因發生甲基化異常改變。Fujiwara K等[22]檢測了91例肺癌患者血漿中的p16,MGMT、DAPK、RASSF1A和RAR-β基因,其中45例患者存在甲基化異常現象。Liu JY[23]等也檢測了137例肺癌患者血漿中的p16基因,結果是105例患者存在甲基化現象,說明p16基因與肺癌的相關性比較高,對于肺癌的早期診斷有重要的意義。對于不同的惡性腫瘤,存在高甲基化現象的相關基因也不同,研究顯示前列腺癌與 GSTP1基因[24-25]、腎癌與 VHL基因[26-27]、結直腸與MLH1基因[28]、食管癌與APC基因[29]相關性很高。建立各種惡性腫瘤的相關基因甲基化譜式對于腫瘤的早期診斷、預后判斷及治療都具有重要意義。

循環DNA的甲基化現象與腫瘤細胞DNA的甲基化現象呈現高度的一致性,并且甲基化異常現象先于腫瘤蛋白標志物的出現,對于惡性腫瘤的早期檢測更有優勢,有望成為評價腫瘤狀態的特異性標志物。

3.3 微衛星改變

微衛星(microsatellite)序列,又稱短串聯重復(short tandem repeat,STR)序列,屬于第二代DNA遺傳標記,是由2-6個堿基對作為核心單位,串聯重復排列而成的一類DNA序列,它在人類基因組中分布廣泛且呈高度多態性。腫瘤中微衛星改變主要有兩種:微衛星雜合性的缺失(Loss Of Heterozygosity,LOH)和微衛星不穩定性(Microsatellite Instability,MSI)。

3.3.1雜合性缺失(LOH)

LOH常表現為一條等位基因的突變及另一條等位基因的缺失,通過缺失使得雜合體中原先隱性突變的抑癌基因被顯示出來,可以同時伴有基因兩側標志的缺失,使抑癌基因周圍的區域成為純合子或半合子,LOH可導致抑癌基因的失活,從而參與腫瘤的發生及發展。Allan等[17]對60例未確診但懷疑有肺癌的病例進行研究,檢測了47份支氣管黏膜組織DNA和40份血漿DNA。結果發現,47份支氣管黏膜組織中有13份檢測出了LOH,而這13例患者都被證實患有肺癌,而40份血漿中有13份被檢測出了LOH,這13例患者中有12例被證實患有肺癌,在血漿中檢測出LOH的患者中63%也可在相應的組織內檢測出LOH,而在腫瘤組織內檢測出LOH的患者中有86%也可在血漿中檢測出。說明了檢測血漿中DNA的LOH可以作為早期診斷肺癌的一種手段。

3.3.2微衛星不穩定性(MSI)

MSI指在腫瘤發展的早期由于錯配修復缺陷導致的DNA復制錯誤從而改變了微衛星序列的重復數目,出現滑動的插入及缺失,表現為基因組中簡單重復序列次數的增加或減少,導致微衛星序列不能正常地發揮基因表達調控作用,進而使細胞增殖及分化異常,直接促進了惡性腫瘤形成和發展。Nunes等[18]用8個微衛星不穩定標志研究91例頭頸部鱗癌患者的循環DNA,其中早期者17例,進展期者74例。結果有58例腫瘤組織發生微衛星不穩定性改變,并在17例(29%)患者循環DNA中檢測到類似的改變,說明MSI的檢測對于腫瘤的中早期檢測具有一定的意義。

4 循環DNA的臨床意義

健康人的外周血中只含有極少量的循環DNA,在炎癥及腫瘤患者的外周血中循環DNA的含量明顯增加。如果將檢測外周血DNA水平應用于診斷惡性腫瘤,則必須先排除各類急慢性炎癥和自身免疫性疾病。Leon[3]等很早就提出了監測外周血游離DNA水平在觀察療效、預測復發方面的作用,測定了173例不同惡性腫瘤患者治療前外周血游離DNA的水平并觀察其在放療后的變化,結果表明,有轉移的患者平均 DNA濃度為209±39 μ g/L,而無轉移患者平均為 100±30 μ g/L,有顯著差異。循環DNA水平與腫瘤患者的生存密切相關,手術前檢測循環DNA水平可以初步判斷腫瘤的侵襲轉移潛能及預后,有助于對病人治療方案的選擇。循環DNA分子學改變對腫瘤的早期診斷及預后評估都有重要意義。

也有研究對循環DNA檢測的意義提出不同的觀點[30]。首先,循環DNA的起源沒有一個明確的說法,認定循環DNA的確切來源還存在爭議;再者,循環DNA水平是在一個寬量程、無序的范圍內波動,檢測的時效性是關鍵的因素;最后,由于對血樣標本的處理不同、對照人群選擇的差異和定量分析技術的差異,大量的同類研究之間存在顯著性差異。

5 小結與展望

根據生物學的中心法則,遺傳物質的改變是蛋白質構象和表達的改變的基礎。因此,我們可以想象,每種腫瘤標志物的形成,其前提都存在著特定腫瘤DNA分子的缺失或突變。綜上所述,檢測外周血游離DNA對腫瘤的早期診斷、療效監測及預后評價等都具有重要意義。筆者認為,盡管循環DNA的應用還有一些問題存在,但循環DNA的獲得只需要患者的血清或血漿,較容易,可以發展成為一種方便、特異、無創的分子生物學檢測手段,用于腫瘤的早期診斷和預防。另外,利用國內外建立的組織標本庫等生物學資源,開展大規模的流行病學的監控,系統的收集癌癥患者的血清標本,建立循環DNA定量檢測的標準化程式以及各類型腫瘤定性分析的相關譜式,應作為未來研究的重點。唯有如此,循環DNA檢測才能作為一種標準化的方法應用于臨床。在未來的幾年里,相信隨著科學技術的發展,循環DNA檢測技術的標準化,循環DNA在腫瘤的早期診斷和檢測方面會得到廣泛的應用。

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