胰島素抵抗對大鼠腦海馬區(qū)Aβ蛋白表達的影響及認知行為學的改變

呂愛紅 朱帥科 張曉曼

鄭州市第一人民醫(yī)院 鄭州 450004

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是以學習、記憶等認知功能下降為臨床特征的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,β-淀粉樣蛋白(β-amyloid,Aβ)沉積是 AD的主要病理學特征。較多研究證實2型糖尿病影響認知功能,而AD被認為是一種3型糖尿病[1]。胰島素抵抗是2型糖尿病病理機制之一,本實驗通過觀察胰島素抵抗大鼠腦海馬區(qū)Aβ的表達及認知功能的改變,旨在探討胰島素抵抗與AD的關(guān)系,為AD的發(fā)病機制提供一定的基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 4～5周齡清潔級健康雄性Wistar大鼠30只,體質(zhì)量180～200 g,購于鄭州大學實驗動物中心。兔 Aβ40一抗(購于武漢博士德生物工程有限公司),辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),血糖儀(美國強生公司產(chǎn)品),Morris水迷宮(北京碩林苑科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型制備和分組：將30只Wistar雄性大鼠,按照隨機數(shù)字表法分組,每組15只。正常對照組(NC組)給予標準嚙齒類動物飼料喂養(yǎng),模型組給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)(飼料成分：10%豬油,20%蔗糖,2.5%膽固醇,1%膽酸鹽,6.5%常規(guī)飼料),誘導出胰島素抵抗模型。

1.2.2 Morris水迷宮實驗：水迷宮為一個不銹鋼圓形水池,直徑100 cm,高 60 cm,內(nèi)置無色有機玻璃平臺,平臺高40 cm,在水池壁東西南北部位分別標明入水點。將平臺放在西南象限正中處,迷宮中含牛奶液面高于安全平臺1 cm,水溫(22±1)℃,加適量奶粉使水呈乳白色,實驗期間環(huán)境安靜,迷宮外參照物不變。該實驗歷時5 d,每天上下午2個時間段,每個時間段訓練4次,每次訓練隨機找個入水點,將大鼠面向池壁放入水池,同一次訓練所有大鼠入水點相同,記錄大鼠從入水找到平臺的時間即逃避潛伏期。如果大鼠在120 s內(nèi)沒有找到平臺,將其引向平臺,潛伏期計為120 s。前4 d為訓練期,第5天進行測試。

1.2.3 一般指標的測定：從大鼠尾靜脈取血,用血糖儀檢測血糖。大鼠處死前心臟取血1 mL,離心留取血漿,用放射免疫法檢測胰島素。胰島素抵抗指數(shù)是以穩(wěn)態(tài)模型的胰島素抵抗指數(shù) HOMA-IR=FINS(IU/L)×FPG(mmol/L)/22.5表示。

1.2.4 組織標本及切片制備：水迷宮實驗結(jié)束后,用10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉后,開胸暴露心臟,用生理鹽水100 mL灌洗左心室,可見清涼液體從已剪開的右心耳流出,用4%多聚甲醛固定后,斷頭取腦。冠狀位切取視交叉后1～4 mm的腦組織。

1.2.5 免疫組化檢測Aβ40的表達：石蠟切片常規(guī)脫蠟,脫水,枸櫞酸鹽(p H 6.0)抗原修復液中熱修復 15 min,自然降到室溫。3%H2O2孵育15 min。山羊血清封閉切片,加入一抗Aβ40(1∶100),4℃過夜,二抗及SP試劑,用PBS代替一抗作陰性對照,未出現(xiàn)陽性反應,各步驟均以PBS沖洗。DAB顯色,蘇木素復染,逐層脫水,中性樹膠封片。每只大鼠取5張切片,在200倍光學顯微鏡下進行半定量分析,將每張切片隨機攝取5個視野,圖像采集后用Image-Pro Plus 6.0分析軟件測定陽性物質(zhì)的平均光密度值。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPASS 13.0統(tǒng)計學軟件行t檢驗,實驗數(shù)據(jù)以±s表示,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 空腹血糖、胰島素水平及胰島素抵抗指數(shù) IR組大鼠胰島素水平(28.8±2.8)IU/L,胰島素抵抗指數(shù)5.15±0.38,顯著高于NC組(13.2±3.7,2.17±0.24),差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01),而 IR組空腹血糖(5.47±0.34)較 NC組(5.59±0.36)略增高,組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

2.2 Morris水迷宮實驗成績 與NC組的(30.61±10.8)s相比,IR組大鼠逃避潛伏期(78.56±9.1)s明顯延長(P＜0.01)。

2.3 Aβ40蛋白表達結(jié)果 鏡下觀察可見 Aβ40蛋白的陽性表達物為棕黃色沉著物。NC組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元著色較淺,神經(jīng)元細胞排列密集,表達呈弱陽性;與NC組相比,神經(jīng)元細胞排列稀疏,IR組呈深棕黃色,染色較深,表達呈強陽性。2組Aβ40蛋白平均光密度值差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

3 討論

胰島素抵抗是指胰島素維持正常血糖能力下降的現(xiàn)象,臨床特征為高胰島素血癥,但尚未發(fā)展至2型糖尿病階段。高脂高糖飲食誘導的胰島素抵抗模型更接近人類的發(fā)病機制,本研究通過喂養(yǎng)大鼠高脂高糖飲食12周后檢測2組大鼠血糖水平,差異無統(tǒng)計學意義,而IR組大鼠血漿胰島素水平、胰島素抵抗指數(shù)較正常對照組增高,差異具有統(tǒng)計學意義,表明胰島素抵抗模型建立成功。本實驗中采用Morris水迷宮實驗觀察大鼠的認知行為改變,與對照組相比,胰島素抵抗組大鼠逃避潛伏期延長,提示胰島素抵抗大鼠學習和記憶能力下降。有研究證實胰島素、胰島素受體及胰島素敏感的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白選擇性分布于腦內(nèi)認知功能區(qū),如海馬區(qū),胰島素參與調(diào)節(jié)學習和記憶功能,在大鼠腦室內(nèi)注射胰島素能夠提高大鼠的被動逃避能力,給AD患者靜脈內(nèi)注射胰島素能改善記憶功能,因此,本研究胰島素抵抗大鼠的認知功能下降,推測胰島素的相對缺乏是導致認知功能下降的主要因素。

在AD發(fā)病過程中,Aβ是由 APP先后被β,γ-分泌酶先后裂解而產(chǎn)生,本實驗應用免疫組織化學染色法檢測2組大鼠腦內(nèi)Aβ40蛋白表達,結(jié)果顯示,Aβ40在正常組大鼠腦組織有少量表達,與正常組相比,IR組大鼠海馬區(qū)Aβ40蛋白的表達均較對照組明顯增多(P＜0.01)。海馬區(qū)是與認知功能最密切的一個部位,目前,Aβ確切的功能尚不清楚,有實驗證實,不同濃度的Aβ對神經(jīng)元的影響不同,低濃度的Aβ對神經(jīng)元有營養(yǎng)作用,高濃度的Aβ對神經(jīng)元有神經(jīng)毒性,使樹突和軸突退縮,導致神經(jīng)元減少或缺失,繼而引起學習、記憶功能下降等臨床癥狀[2]。在生理情況下,細胞漿內(nèi)高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運輸Aβ到細胞外,當發(fā)生胰島素抵抗時神經(jīng)元細胞內(nèi)糖代謝發(fā)生異常,ATP生成減少,引起神經(jīng)元細胞胞漿內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體功能下降,繼而導致β-淀粉樣蛋白在胞漿內(nèi)過度沉積[3]。

綜上所述,本實驗從分子生物學證實胰島素抵抗能導致認知功能下降,同時發(fā)現(xiàn)Aβ蛋白表達增加,因此,胰島素抵抗可能參與了AD的發(fā)生與發(fā)展。

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[3]褚文政,錢采韻.側(cè)腦室注射鏈脲霉素引起大鼠腦Aβ1-40和Aβ1-42表達增加[J]. 第四軍醫(yī)大學報,2005,26(15)：1 356-1 358.