革蘭染色的現況和進展

葉元康

·生物診斷技術·

革蘭染色的現況和進展

葉元康

本文對經典的革蘭染色、革蘭染色的自動染色儀、自動染色鑒別直讀儀和革蘭染色智能化與環保節水作一綜述和展望。

革蘭染色（Gram stain）是 1884 年由丹麥醫師 Christain Gram 創立，染色將細菌分為革蘭陽性菌和革蘭陰性菌兩大類，在細菌學的形態鑒定、分類和用藥選擇等方面發揮了重要的作用[1]。世界各國常用的革蘭染色為哈克改良法（Gram stain-Hucher modification），即經典的四步法革蘭染色[2]，該染色使用 4 種試劑：結晶紫的混合液（crystal violet），碘液（iodine），酒精脫色液（alcohol decolorizer）和沙黃復染液（safranin O）。正規的染色時間約需 3 分鐘 45 秒，試劑用量約 16 ml。但是哈克改良法的 crystal violet 在半年內就會出現沉淀，iodine 易自然升化，alcohol decolorizer 易揮發都是導致不良染色結果的重要原因。四步法革蘭染色常受染液質量、實驗者操作和細菌本身變化等因素影響，會將革蘭陽性菌染成紅色或革蘭陰性菌染成紫色，誤導或干擾實際工作，或產生不良后果。四步法革蘭染色步驟多，操作麻煩，易出錯，質量控制不易進行，難以做到標準化[3]。

近年來，革蘭染色技術已有了不少改進：①快速染色，時間在 45 s 左右；②三步法革蘭染色，1994 年美國 Difco公司的產品，將脫色與復染合二為一，可縮短染色時間、減少試劑用量、將脫色標準化和增加準確性；③ 1992 年美國CSM 公司的 Gram stain enhancer 能增強結晶紫的染色；④以stabilized iodine取代傳統的碘液：穩定碘液為polyvinylpyrrolidone（PVP）iodine 可維持有效期達 15 個月之久；⑤ 以 Gram basic fuchsin 取代 Gram safranin 染厭氧菌、彎曲菌和李氏特菌更鮮紅；⑥二步法革蘭染色，2010年中國無錫 Faye 公司的產品，第一步為結晶紫初染，染色6 s，第二步為碘、酒精和品紅混合液復染，染色 3 s，能得出與三步法和四步法一樣的結果。二步法革蘭染色液可穩定12 個月，節省生產原料 25％、降低生產成本30％、物流成本 50％ 和染色節水 50％。二步法染色工作效率比三步法和經典的四步法提高 3 ～ 4 倍[3-6]。

革蘭染色的意義：①確定細菌的染色性，染成紫色的陽性菌或紅色的陰性菌；②確定細菌的形態，有球菌、桿菌、弧菌等；③有芽胞的桿菌和絕大多數的球菌，以及所有的放線菌和真菌都呈陽性；弧菌，螺旋體和大多數致病性的無芽胞桿菌都呈陰性；④細菌性腦膜炎、肺炎、菌尿、淋病、腦、肺、腹部的感染和創傷時，革蘭染色非常有用。例如疑似細菌性腦膜炎和關節炎患者的檢樣直接涂片染色發現病菌，可在獲得培養結果前提供病原的參考；泌尿生殖道的檢樣，若發現革蘭陰性雙球菌，可作為診斷淋病的參考；女性陰道直接涂片，根據乳酸桿菌在鏡下視野中的比例，有無滴蟲或念珠菌的假菌絲和芽生孢子，可判斷細菌性、念珠菌性或滴蟲性陰道炎；⑤分離培養的菌落，細菌鑒定的第一步為革蘭染色，根據染色性和形態，來確定下一步再做哪些試驗；⑥在獲得藥敏結果前，革蘭染色可作為醫師選用抗生素的參考，革蘭陽性菌對青霉素類抗生素敏感，革蘭陰性菌對對氨基糖苷類抗生素敏感[7-8]。

鑒于革蘭染色的重要性，革蘭染色液和染色方法的質量控制尤為重要。臨床微生物實驗室都需要進行革蘭染色液和染色方法的質量控制，通常用大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的標準菌株進行，每批試劑每周至少 1 次質量控制，衛生部已制定了微生物實驗室的全國臨床檢驗操作規程。近年已有商品化的革蘭染色用質量控制片，該產品是在玻片上涂有大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的標準菌株未染部位，可監控染色液和染色方法的誤差。商品化的革蘭染色用質量控制片具有以下優點：①節省實驗室進行革蘭染色質控時制備培養基、培養質控菌株、保存質控菌株的時間和經費；②可對染色液、染色方法和細菌變異進行監控；③可做到質控菌培養的時間、涂片的菌量和制片的標準化。商品化的革蘭染色用質量控制片是值得提倡的[9-10]。

目前國內外對微生物和細胞的染色、鏡檢和結果處理主要是靠人工操作。人工操作需要訓練有素的人員；人工操作樣本間誤差大，缺乏可靠性和重現性，有人為和系統影響；人工操作難以質量控制、不易做到標準化；人工操作工作效率低；人工操作有染色廢水污染環境；人工操作水資源消耗較大。鑒于人工操作的染色、鏡檢和結果處理的缺點，市場上已有自動革蘭染色儀產品，如生物梅里埃公司（法國，2008年）、BD 公司（美國，2009 年）和賽德利公司（西班牙，2009 年），使得革蘭染色實現了自動化。自動化染片能夠節約時間，保證染片的準確性。無錫飛伊生物科技有限公司研制出新一代的自動染色鑒別直讀儀（中國，2011年）克服了現有的自動染色儀不能顯微照相和信息處理的不足。該儀器除能自動進行染色外，還能自動鏡檢、攝像和直接放大屏顯染色結果，其 2TB 的硬盤存儲器和網絡聯接功能，能調取、查詢歷史資料、建立患者檔案、共享信息和做臨床會診。

革蘭染色在細菌學的形態鑒定、分類和用藥選擇有重要的作用[11-12]。革蘭染色隨著科學技術的進步也會與時俱進。在自動化染色、自動化鏡檢和圖像放大直讀的基礎上，今后的努力方向：①實現染色廢水的凈化處理和循環利用，做到環保節水；②建立臨床樣本和比對的標準數據庫，做成能智能化比對的工作站；③研制出適用于革蘭、抗酸、和血細胞染色的一機多用的新儀器。

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10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2011.06.006

200065 上海，同濟大學附屬同濟醫院性病實驗室，Email：yeying784@sohu.com

2011-11-14