牛磺膽酸鈉誘導的急性壞死性胰腺炎大鼠基因表達譜變化

朱國英 朱風尚 黃東平 沈曉瑩 宋振云 郜恒駿

·短篇論著·

牛磺膽酸鈉誘導的急性壞死性胰腺炎大鼠基因表達譜變化

朱國英 朱風尚 黃東平 沈曉瑩 宋振云 郜恒駿

基因芯片技術是高通量的差異基因表達研究手段。通過雜交后的生物信息學分析有助于全面了解復雜基因和信號轉導通路在急性壞死性胰腺炎(ANP)中的作用。因此，利用全基因組表達譜方法分析ANP基因的變化較單個基因的研究具有理論上的優勢。李磊等[1]曾報道，腹腔注射雨蛙肽誘導的急性水腫性胰腺炎(AEP)基因表達譜的變化，但尚未見類似臨床重癥急性胰腺炎(SAP)的ANP模型的胰腺組織基因表達譜的報道。故本實驗觀察ANP大鼠胰腺組織基因表達譜的變化。

一、材料與方法

1．動物分組及模型制備：SD大鼠40只，體重180～230 g，雌雄各半，上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供(SPF級，合格證號：SCXK滬2003-0002)。按隨機數字表法分為對照組和ANP組，各20只。適應性喂養1周后，參照文獻[2]，采用胰管逆行注入4%牛磺膽酸鈉(上海國藥集團)0.1 ml/100 g體重方法制備ANP模型。對照組注入等容積的生理鹽水。術后48 h記錄存活率，處死大鼠，取血、胰腺組織。

2．血清淀粉酶和C-反應蛋白(CRP)檢測：血清淀粉酶和CRP檢測試劑盒購自上海豐翔生物科技有限公司，參照說明書操作。

3．胰腺組織病理檢查：取固定的胰腺組織，常規切片、HE染色，光鏡下觀察組織病理變化，并采用Schmidt法[3]進行評分。

4．胰腺組織基因芯片分析：取液氮凍存胰腺組織，研磨成勻漿，離心取上清。常規Trizol法提取總RNA。采用Illumina TotalPrep RNA擴增試劑盒(上海芯超生物科技有限公司提供)完成RNA一步法逆轉錄反應合成cDNA和純化，再由cDNA合成aaUTP標記的cRNA并純化。用Cy-3標記cRNA探針，Illumina雜交試劑盒使cRNA探針片段化。將Illumina大鼠全基因組表達譜基因芯片置于Ilumina激光共聚焦光微珠芯片(Sentrix BeadChip)平臺上與胰腺cRNA樣本進行雜交。

以Illumina BeadChip Reader掃描系統獲取數字信號，BeadStudio軟件分析熒光信號強度和分析比值。以Cubic Spline法行歸一化處理，篩選差異基因。用在線DAVID生物信息學分析工具(http:∥david.abcc.ncifcrf.gov)和Gene Ontology(GO)分類標準數據庫(http:∥www.geneontology.org)分析差異表達基因涉及的生物學過程、分子功能和細胞組分[4]；采用KEGG數據庫的基因信號通路分析差異基因涉及的生物學通路[5]。

5．差異基因F11r和Cdh1驗證：采用熒光定量RT-PCR法。F11r(NM_053796)正義鏈5′-TGTCCTGGTAACACTGATTCTCC-3′，反義鏈5′-CAGGAATGACGAGGTCTGTTTG-3′，片段172 bp；Cdh1(NM_031334)正義鏈5′-CCTTGATGCCAGACCGGAAGT-3′，反義鏈5′-GGTCACTGTCCGCTGCCTTC-3′，片段140 bp；內參β-actin(NM_031144)正義鏈5′-TTTTGTGCCTTGATAGTTCGC-3′，反義鏈5′-GAGTCCTTCTGACCCATACCC-3′，片段264 bp。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。PCR條件：95℃ 3 min，94℃ 30 s、52℃ 30 s、72℃ 30 s，35個循環。通過ABI Prism 7500 SDS Software獲得Ct值。ΔCt=Ct目標基因-Ct內參，mRNA相對表達量為2-ΔCt×100%。

6．統計學分析：采用SPSS13.0統計軟件分析，其中正態分布計量資料用Student的t檢驗，率用χ2檢驗，非正態資料采用秩和檢驗。差異基因GO分類采用Fisher精確檢驗和χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

二、結果

1．動物48 h存活率及血清淀粉酶和CRP水平：對照組死亡2只，ANP組死亡8只，對照組存活率明顯高于ANP組(P=0.028)。ANP組大鼠血清淀粉酶和CRP水平分別為(7892±1776)U/L、(106.5±19.9)mg/L，均顯著高于對照組的(1296±326)U/L、(61.7±15.9)mg/L(P=0.000，P=0.002)。

2．胰腺病理改變：對照組胰腺輕度水腫，呈乳白色，無壞死；ANP組胰腺及周圍脂肪呈黑褐色，壞死明顯。對照組胰腺鏡下見組織結構清晰，腺泡細胞內無空泡、間質無明顯水腫、無白細胞浸潤，病理評分為4.0±1.4；ANP組胰腺腺泡腫脹明顯，大量空泡，不同程度壞死，間質有炎細胞浸潤及出血，病理評分為10.3±2.2，較對照組明顯升高(P=0.004)。

3．差異基因表達譜：比較對照組和ANP組胰腺全基因表達譜，共篩選到28個差異基因，其中上調23個，為regenerating islet-derived 3 gamma(Reg3g)；activating transcription factor 3(Atf3)；lamimin, gamma 2(Lamc2)；Rho family GTPase 1 (predicted) (Rnd1)；TG interacting factor (predicted) (Tgif)；potassium channel, subfamily K, member 1 (Kcnk1)；fucosyltransferase 2 (secretor status included) (Fut2)；RAB30, member RAS oncogene family(predicted) (Rsb30)；transformation related protein 53 inducible nuclear protein 1 (Trp53inp1)；coxsackie virus and adenovirus receptor (Cxadr)；keratin complex 2, basic, gene 8 (Krt2-8)；tetraspan 1 (MGC93753)；von Hippel-Lindau syndrome homolog (Vhl)；mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase 4 (predicted) (Map4k4)；UDP-N-acetyl-alpha-D-galactosamine:polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 3 (predicted) (Galnt3)；tumor differentially expressed 2-like (predicted) (Tde2l)；iGb3 synthase (LOC171553)；adenosine monophosphate deaminase 3 (Ampd3)；B-cell translocation gene 2, anti-proliferative (Btg2)；24-dehydrocholesterol reductase (predicted) (Dhcr24)；fatty acid amide hydrolase (Faah)；junctional adhesion molecule 1 (F11r)；cadherin 1 (Cdh1)。下調5個，為ATPase, Ca2+transporting, ubiquitous (Atp2a3)；nephrosis 1 homolog, nephrin (human) (Nphs1)；methylcrotonoyl-Coenzyme A carboxylase 1 (alpha) (Mccc1)；hypothetical gene supported by BC087105 (LOC500856)；similar to Integral membrane protein 2A (LOC317218)。

通過GO分類得到32個GO注釋條目，其中涉及生物學過程共10個GO，主要包括細胞黏附和黏附生物學、糖基化、Caspase活性調節、肽酶(含內肽酶)活性調節等過程。涉及的分子功能主要包括鈣離子結合、金屬離子跨膜轉運蛋白活性(含陽離子)、水解酶/連接酶活性、碳水化合物結合、糖基轉移酶活性等10個GO。涉及細胞組分方面的GO有9個，主要是細胞間連接、緊密連接、耦合連接、高爾基體功能等。在GO注釋到的差異基因中被注釋到頻數最高的5個基因是：結合黏附分子-1受體(F11r)、鈣黏蛋白-1(Cdh1)、遍在鈣離子轉運ATP酶(Atp2a3)、層黏蛋白-γ2(Lamc2)、柯薩奇和腺病毒受體(Cxadr)，其中Atp2a3為下調基因，F11r、Cdh1、Lamc2、Cxadr為上調基因。

獲得KEGG生物學通路數據注釋有3個，其中有9個差異基因，上調基因為8個(Cdh1、Vhl、F11r、Dhcr24、Ampd3、Galnt3、Fut2、Lamc2)，下調的有1個(Mccc1)，代表的生物學通路主要為細胞黏附分子通路、代謝通路、腫瘤信號通路，其中代表前兩個通路的基因表達均上升。

4．差異基因驗證：對感興趣的細胞黏附分子通路中的兩個基因F11r、Cdh1進行實時PCR驗證。ANP組胰腺F11r、Cdh1 mRNA相對表達量分別是對照組的2.047、3.238倍，與基因芯片的比值2.657、3.151相吻合。

討論Nakada等[6]報道雨蛙肽誘導的急性胰腺炎(AP)小鼠胰腺基因表達譜的變化，F11r和Cdh1mRNA表達明顯升高。Dusetti等[7]用含7981個基因的小鼠表達譜芯片研究了正常和AP小鼠間胰腺組織差異基因，共發現239個基因變化，107個基因上調，132個基因下調，其中細胞黏附類基因在AP發病中起重要作用。Ji等[8]應用牛磺膽酸體外干預大鼠胰腺腺泡細胞，結果顯示51個基因顯著變化，并認為EGR-1是觸發胰腺炎重要的調節因子。本結果顯示，ANP時胰腺有28個基因表達發生明顯變化。經過GO和Pathway篩選，均包含的差異基因中，F11r、Cdh1出現的頻次和權重最高。這兩個基因均參與鈣離子和細胞黏附分子通路，提示傳統的鈣離子超載理論和細胞黏附分子改變在ANP發病中的重要作用在全基因表達譜上得到了證實。通過實時PCR對F11r、Cdh1mRNA的表達量進行驗證，其結果和基因芯片一致，說明了基因芯片的可靠性。但F11r、Cdh1在ANP發病中的具體機制尚需進一步研究[9]。

細胞因子和炎癥介質的放大在ANP發病中有重要作用，而本研究差異基因中沒有表現出來，可能原因是時間節點較晚，而細胞因子大多已釋放到外周血所致[10]。

[1] 李磊,王興鵬,吳愷.雨蛙肽誘導的急性胰腺炎小鼠基因表達譜研究.中華醫學雜志,2005,82:122-123.

[2] 朱國英,李永渝,李學禮.急性胰腺炎大鼠胰、肝組織IκBα的表達及中藥新清胰湯的影響.中國病理生理雜志,2006,22:2438-2442.

[3] Deng LH, Xiang DK, Xue P, et al. Effects of Chai-Qin-Cheng-Qi Decoction on cefotaxime in rats with acute necrotizing pancreatitis. World J Gastroenterol, 2009, 15:4439-4443.

[4] Huang DW, Sherman BT, Lempicki RA. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nature Protoc, 2009, 4:44-57.

[5] 陳蕾,王世鑫,劉萍,等.染矽塵大鼠早期肺組織差異基因表達譜的研究.中華預防醫學雜志,2008,42:515-521.

[6] Nakada S, Tsuneyama K, Kato I, et al. Identification of candidate genes involved in endogenous protection mechanisms against acute pancreatitis in mice. Biochem Biophys Res Commun, 2010, 391:1342-1347.

[7] Dusetti NJ,Tomasini R,Azizi A,et al.Expression profiling in pancreas during the acute phase of pancreatitis using cDNA microarrays.Biochem Biophys Res Commun,2000,277:660-667.

[8] Ji B, Chen XQ, Misek DE,et al. Pancreatic gene expression during the initiation of acute pancreatitis: identification of EGR-1 as a key regulator. Physiol Genomics, 2003, 14:59-72.

[9] Petersen OH.Ca2+signaling in pancreatic acinar cells: physiology and pathophysiology. Braz J Med Biol Res, 2009, 42:9-16.

[10] Dambrauskas Z, Giese N, Gulbinas A, et al. Different profiles of cytokine expression during mild and severe acute pancreatitis. World J Gastroenterol, 2010, 16:1845-1853.

2011-01-07)

(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.06.021

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200060 上海，上海市普陀區人民醫院院內感染科(朱國英)，普外科(黃東平)；同濟大學附屬同濟醫院消化疾病研究所(朱風尚，郜恒駿)；生物芯片上海國家工程研究中心(沈曉瑩，宋振云，郜恒駿)

朱風尚，Email: zhufengshang@126.com