胰島素瘤抑癌基因p27的表達(dá)及其與CpG島甲基化表型的關(guān)系

周喬 肖雨 朱麗明 向紅丁 陳元方 陳原稼

·論著·

胰島素瘤抑癌基因p27的表達(dá)及其與CpG島甲基化表型的關(guān)系

周喬 肖雨 朱麗明 向紅丁 陳元方 陳原稼

目的探討胰島素瘤抑癌基因p27的表達(dá)及其與CpG島甲基化表型(CpG island methylation phenotype, CIMP)間的關(guān)系。方法用免疫組化方法檢測27例胰島素瘤組織及11例瘤旁正常胰腺組織中p27的表達(dá)。用甲基化特異性PCR (MSP) 方法檢測這些組織中p16、MLH1、RAR-β、MGMT、THBS1基因的甲基化狀態(tài)。分析p27表達(dá)、CIMP與臨床病理參數(shù)間的相關(guān)性。結(jié)果胰島素瘤組織p27蛋白表達(dá)陽性率較瘤旁胰腺組織顯著降低(48%比91%，P=0.008)。胰島素瘤組織的高CIMP發(fā)生率為33%(9/27)，瘤旁正常胰腺組織的高CIMP發(fā)生率為18%(2/11)，腫瘤組織為正常胰腺組織的2倍,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.350)。胰島素瘤的MGMT甲基化與p16的甲基化呈顯著負(fù)相關(guān)(P=0.004)，胰島素瘤的p27表達(dá)與高CIMP呈負(fù)相關(guān)的趨勢,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.420)；p27的表達(dá)和CIMP的發(fā)生與胰島素瘤的臨床病理參數(shù)均無顯著相關(guān)性。結(jié)論胰島素瘤p27表達(dá)下調(diào)，并存在高CIMP,提示p27的失活和多基因的表觀遺傳學(xué)異常在該腫瘤的發(fā)生過程中可能起一定作用。

胰腺內(nèi)分泌腫瘤; 胰島素瘤; 抑癌基因p27; CIMP; 甲基化

胰島素瘤是胰腺內(nèi)分泌腫瘤中最常見的一種。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)[1]，部分散發(fā)性胰島素瘤和MEN-1基因失活有關(guān)。近期的研究又發(fā)現(xiàn)胰島素瘤中錯配修復(fù)基因異常,特別是MLH1基因發(fā)生高甲基化[2-3]。文獻(xiàn)報(bào)道[4]，在小鼠MEN1突變所導(dǎo)致的胰島素瘤中,p27的表達(dá)下降。因此，本實(shí)驗(yàn)觀察人胰島素瘤p27的表達(dá)，分析其與CpG島甲基化表型(CpG island methylation phenotype, CIMP)的相關(guān)性，以探尋該腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制。

材料與方法

一、標(biāo)本來源及診斷標(biāo)準(zhǔn)

收集1992年至2008年北京協(xié)和醫(yī)院手術(shù)切除經(jīng)病理證實(shí)的27例胰島素瘤標(biāo)本，以11例瘤旁胰腺組織作為對照。 胰島素瘤的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照我們已往發(fā)表的文章[3, 5-6]。

二、p27表達(dá)的檢測

采用小鼠二步法免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物試劑有限公司)檢測p27蛋白表達(dá)。小鼠抗人p27單抗(BD公司)1∶100稀釋。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)按照我們以往研究[2-3]：細(xì)胞核有棕黃著色者為陽性細(xì)胞。陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分值>20%為表達(dá)陽性。

三、p16、MLH1、RAR-β、MGMT、THBS1的CIMP的測定

按我們以往的方法[3]從冷凍組織和石蠟組織標(biāo)本中提取基因DNA，并行甲基化修飾。各基因啟動子的PCR引物序列見表1。采用甲基化特異性PCR(MSP)及非甲基化特異性PCR(USP)法檢測基因CpG島的甲基化狀態(tài)。結(jié)果判定：腫瘤組織中有4～5個基因出現(xiàn)甲基化為高CIMP； 0～3個基因出現(xiàn)甲基化為低CIMP。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,率的比較采用Fisher精確檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、一般臨床資料

27例胰島素瘤患者中男性8例，女性19例，年齡16～74歲，平均(48±3)歲。術(shù)前血清胰島素水平為(58.1±9.2)mU/L，中位數(shù)49.7mU/L；術(shù)前血糖水平為(2.8±0.2)mmol/L，中位數(shù)2.5 mmol/L。胰島素瘤位于胰頭頸部16例(59%)，胰體尾部11例(41%)。瘤體最大徑≥2 cm者12例(44%),<2 cm 15例(56%)。經(jīng)病理證實(shí)，21例(78%)為良性,6例(22%)為惡性。

二、p27蛋白表達(dá)

p27蛋白位于腫瘤細(xì)胞的胞核(圖1)，腫瘤組織p27陽性表達(dá)率為48%(13/27)；瘤旁正常組織中，p27蛋白主要位于胰島內(nèi),導(dǎo)管上皮和腺泡細(xì)胞表達(dá)較少，陽性表達(dá)率為91%(10/11)。胰島素瘤p27蛋白表達(dá)率明顯低于瘤旁正常胰腺組織(P=0.008)。

表1 各基因啟動子的PCR引物序列

注： RKO為結(jié)腸癌細(xì)胞系，803為胃癌細(xì)胞系，PA-1為人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系

圖1胰島素瘤旁胰腺組織和瘤組織的病理變化(a、c；HE ×200)和p27蛋白表達(dá)(b、d；免疫組化染色 ×200)

三、胰島素瘤組織CIMP的狀況

部分組織的CpG島甲基化測定結(jié)果如圖2所示。27例腫瘤組織中,p16的甲基化比例為33%(9/27)，MLH1為81%(22/27)，RAR-β為96%(26/27)，MGMT為81%(22/27)，THBS1為30%(8/27)；高CIMP發(fā)生率為33%(9/27)。11例瘤旁正常胰腺組織中高CIMP發(fā)生率為18%(2/11)。腫瘤組織高CIMP發(fā)生率為對照胰腺組織的2倍,但由于例數(shù)較少,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無顯著差異(P=0.350)。在發(fā)生p16甲基化的9例胰島素瘤組織中有4例(44%)同時存在MGMT甲基化,而未發(fā)生p16甲基化的18例腫瘤中均發(fā)生了MGMT甲基化,二者之間存在顯著負(fù)相關(guān)(P=0.004)。

M：甲基化條帶，U：無甲基化條帶

圖2胰島素瘤組織p16(a)、MLH1(b)的MSP及USP擴(kuò)增結(jié)果

四、CIMP與p27表達(dá)的相關(guān)分析

14例p27表達(dá)丟失或下降的腫瘤中有6例(43%)發(fā)生高CIMP,而13例p27表達(dá)正常的腫瘤中僅3例(23%)發(fā)生高CIMP，p27表達(dá)與高CIMP呈負(fù)相關(guān)的趨勢,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.420)。

五、CIMP與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

CIMP的高低與患者性別、年齡、術(shù)前胰島素水平、術(shù)前空腹血糖水平、腫瘤部位、腫瘤大小、良惡性及療效均不相關(guān)(表2)。單獨(dú)將每個基因的甲基化與臨床病理資料進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)MGMT的甲基化與腫瘤部位具有相關(guān)性(P=0.047),顯示原發(fā)部位在胰頭的胰島素瘤更易發(fā)生MGMT甲基化,而MGMT非甲基化的腫瘤多位于胰體尾。

表2 CIMP與胰島素瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系

六、腫瘤組織p27表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

胰島素瘤組織p27表達(dá)與患者性別、年齡、術(shù)前胰島素水平、空腹血糖水平、腫瘤部位、腫瘤大小、良惡性及預(yù)后均不相關(guān)(表3)。

表3 腫瘤組織p27表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

討 論

胰島素瘤是最常見的胰腺內(nèi)分泌腫瘤之一,其發(fā)生的分子病理學(xué)機(jī)制目前仍不明確,并且臨床上缺乏有效的診斷及鑒別良惡性的分子標(biāo)記物。 文獻(xiàn)報(bào)道在結(jié)直腸癌[7]、乳腺癌[8]、胰腺癌[9]等多種腫瘤中觀察到了CIMP現(xiàn)象。CIMP現(xiàn)象可能在腫瘤的篩查、診斷、高危人群評估、制定最適治療方案中起作用[10]。p27屬于細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，其表達(dá)水平在乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺腺癌等多種腫瘤亦有所下降,在結(jié)腸癌中,p27與高CIMP存在顯著相關(guān)性[7]。本實(shí)驗(yàn)檢測胰島素瘤p27蛋白表達(dá), 結(jié)果提示p27在胰島素瘤的表達(dá)降低，與文獻(xiàn)結(jié)果一致。

文獻(xiàn)報(bào)道[11-13]，甲基化、磷酸化或經(jīng)泛素途徑的降解增加等可能是p27表達(dá)下降的原因。我們根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室以往的研究結(jié)果及文獻(xiàn)報(bào)道挑選了p16、MLH1、RAR-β、MGMT和THBS1等5個基因作為本實(shí)驗(yàn)的一組CIMP標(biāo)記基因。 通過對27個胰島素瘤標(biāo)本和11個瘤旁正常胰腺組織這5個基因的甲基化測定,顯示腫瘤組織中高CIMP發(fā)生率高于正常胰腺組織, 但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 其原因可能是：(1)樣本量較小；(2)瘤旁組織中有3個出現(xiàn)高CIMP現(xiàn)象,提示部分瘤旁正常組織已經(jīng)發(fā)生了分子的改變；(3)對高CIMP的定義不同。文獻(xiàn)以2個或2個以上基因出現(xiàn)甲基化定義為高CIMP[14],而我們以4個及4個以上 (≥4/5) 出現(xiàn)甲基化定義為高CIMP。

文獻(xiàn)報(bào)道[15]，腫瘤中MGMT的甲基化往往與其他抑癌基因,如p21、p16和MLH1的甲基化呈正相關(guān)。本研究通過對這5個基因CIMP之間相互關(guān)系的分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織p16甲基化與MGMT甲基化間存在顯著負(fù)相關(guān)性。而在瘤旁正常組織中,兩者無相關(guān)性。此外，通過對CIMP和p27表達(dá)的分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織p27表達(dá)下降，高CIMP發(fā)生率增加，而在正常胰腺組織與此正好相反，提示p27的表達(dá)下降可能和高CIMP發(fā)生率增高有關(guān),兩者可能在散發(fā)型胰島素瘤的發(fā)生中起作用,闡明其中的分子機(jī)制或有助于為散發(fā)型胰島素瘤的診治提供參考。

[1] 蔣衛(wèi)君,劉彤華,陳杰,等.胰島素瘤頻發(fā)MEN-1抑癌基因及22q的雜合缺失及其意義.中華醫(yī)學(xué)雜志,2004,84:1705-1709.

[2] 梅玫, 陳原稼, 魯重美, 等. 錯配修復(fù)基因hMSH2在散發(fā)性胰島素瘤中的表達(dá)及臨床意義. 中華胰腺病學(xué)雜志, 2009,9: 375-376.

[3] Mei M, Deng D, Liu TH, et al. Clinical implications of microsatellite instability and MLH1 gene inactivation in sporadic insulinomas. J Clin Endocrinol Metab, 2009, 94: 3448-3457.

[4] Fontanière S, Casse H, Bertolino P, et al. Analysis of p27(Kip1) expression in insulinomas developed in pancreatic beta-cell specific Men1 mutant mice. Fam Cancer, 2006, 5:49-54.

[5] Yang YM, Liu TH, Chen YJ, et al. Chromosome 1q loss of heterozygosity frequently occurs in sporadic insulinomas and is associated with tumor malignancy. Int J Cancer, 2005, 117:234-240.

[6] 朱預(yù), 趙玉沛.胰腺內(nèi)分泌腫瘤的診治. 中華肝膽外科雜志, 2003, 9: 452-453.

[7] Ogino S, Kawasaki T, Kirkner GJ, et al. Loss of nuclear p27(CDKN1/KIP1) in colorectal cancer is correlated with microsatellite instability and CIMP. Mod Pathol, 2007,20:15-22.

[8] Widschwendter M, Siegmund KD, Müller HM, et al. Association of breast cancer DNA methylation profiles with hormone receptor status and response to tamoxifen. Cancer Res, 2004, 64:3807-3813.

[9] Ueki T, Toyota M, Sohn T, et al. Hypermethylation of multiple genes in pancreatic adenocarcinoma. Cancer Res,2000,60:1835-1839.

[10] Laird PW.The power and the promise of DNA methylation markers. Nat Rev Cancer, 2003,3:253-266.

[11] Qian X, Jin L, Kulig E, et al.DNA methylation regulates p27kip1 expression in rodent pituitary cell lines. Am J Pathol, 1998, 153:1475-1482.

[12] Vlach J, Hennecke S, Amati B. Phosphorylation-dependent degradation of the cyclin-dependent kinase inhibitor p27. EMBO J, 1997, 16:5334-5544.

[13] Pagano M,Tam SW, Theodoras AM, et al.Role of the ubiquitin-proteasome pathway in regulating abundance of the cyclin-dependent kinase inhibitor p27. Science,1995,269:682-685.

[14] Arnold CN, Sosnowski A, Schmitt-Gr?ff A, et al. Analysis of molecular pathways in sporadic neuroendocrine tumors of the gastro-entero-pancreatic system. Int J Cancer, 2007,120:2157-2164.

[15] Esteller M, Hamilton SR, Burger PC, et al. Inactivation of the DNA repair gene O6-methylguanine-DNA methyltransferase by promoter hypermethylation is a common event in primary human neoplasia. Cancer Res, 1999, 59:793-797.

2011-05-11)

(本文編輯：呂芳萍)

OccurrenceofCpGislandmethylationphenotypeandexpressionofp27ininsulinoma

ZHOUQiao,XIAOYu,ZHULi-ming,XIANGHong-ding,CHENYuan-fang,CHENYuan-Jia.

DepartmentofGastroenterology,PekingUnionMedicalCollegeHospital;ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,Beijing100733,China

CHENYuan-jia,Email:yuanjchen@gmail.com

ObjectiveTo study the expression of p27 and its relationship with CpG island methylation phenotype (CIMP) in insulinoma.MethodsExpression of p27 was tested in 27 insulinoma tissues and 11 paired control tissues by immunohistochemistry staining. CpG island methylation of p16，MLH1，RAR-β,MGMT,THBS1(CIMP ) was detected in 27 insulinoma tissues and 11 paired control tissues by methylation specific PCR (MSP). The data of p27 and CIMP expression were correlated with the clinicopathological characteristics.ResultsThe positive expression rate of p27 in insulinoma tissues was significantly lower than that in paired control tissues (48%vs91%,P=0.008). High rate of CIMP occurrence in insulinoma tissues was 33% (9/27), while it was 18%(2/11) in paired control tissues, and difference between the two groups was not statistically significant (P=0.350). The methylation of MGMT was reversely associated with p16 methylation (P=0.004). p27 expression in insulinoma tissues was reversely associated high rate of CIMP occurrence but it was not statistically significant (P=0.420). Neither the expression of p27 nor the occurrence of CIMP was associated with the clinicopathological features.ConclusionsDown-regulation of p27 and high rate of CIMP occurred in insulinomas, suggesting that the inactivation of p27 and epigenetic alterations of several genes might contribute to the carcinogenesis of insulinoma.

Pancreatic endocrine neoplasms; Insulinoma; Tumor suppressor gene p27; CIMP; Methylation

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.06.011

100730 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院消化內(nèi)科(周喬、朱麗明、陳元方、陳原稼)，內(nèi)分泌科衛(wèi)生部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(向紅丁)，病理科(肖雨)(周喬現(xiàn)在四川省人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，成都 610072)

陳原稼,Email: yuanjchen@gmail.com