胰腺癌干細胞研究進展

朱柱 王春友

·綜述與講座·

胰腺癌干細胞研究進展

朱柱 王春友

數十年來，胰腺癌長期生存率并無顯著改善，很大程度上歸咎于現有治療手段忽略了腫瘤的異質性特征。大量研究表明[1-4]，腫瘤由少數腫瘤干細胞和大多數分化細胞組成，前者具有自我更新和分化能力并形成與維持腫瘤，而后者增殖潛能有限。自1997年Bonnet等[1]首先在人類急性粒細胞白血病中發現腫瘤干細胞以來，科學家們已相繼在乳腺癌、結腸癌、胰腺癌等[2-4]實體腫瘤中證實了腫瘤干細胞的存在，同時還發現其與腫瘤的發生、發展、侵襲、轉移等特征密切相關。由此可見，胰腺癌干細胞研究對于探討胰腺癌發病機制及指導臨床治療具有十分重要的意義。

一、胰腺癌干細胞的分離和鑒定

Li等[4]于2007年運用免疫缺陷小鼠移植瘤模型和熒光激活細胞分選法(fluorescence activated cell sorting, FACS)從癌組織中首次分離并鑒定了表型為CD44+CD24+ESA+的胰腺癌干細胞。該亞群在胰腺癌組織中僅占0.2%～0.8%，但成瘤能力為非腫瘤干細胞(CD44-CD24-ESA-)的100倍，接種后形成的腫瘤與原發瘤組織學特征十分相似。此外，該亞群體內連續傳代后仍能形成包含CD44+CD24+ESA+和CD44-CD24-ESA-表型的異質性腫瘤細胞，表明其具有自我更新和分化能力。隨后，Hermann等[5]應用免疫磁珠細胞分選法(magnetic activated cell sorting, MACS)從癌組織中分離并鑒定了表型為CD133+的胰腺癌干細胞。該亞群約占胰腺癌組織的1.8%，具有極強的成瘤能力，表現為106個CD133-細胞接種后無法成瘤，而106個未分選細胞或僅500個CD133+細胞即可成瘤。體內連續傳代后成瘤能力逐漸增強，而且可以產生CD133+和CD133-的異質性腫瘤細胞。

二、細胞系

Gou等[6]運用球培養法富集胰腺癌PANC1細胞系中具有干細胞特性的亞群，發現該亞群能夠外排Hoechst 33342染料且連續傳代后產生能夠外排和無法外排該染料的子代細胞，高表達LY6E、TACSTD1、CD44等干細胞表面標志分子。此外，該亞群成瘤能力較強，5×105個細胞和107個未富集細胞成瘤能力相當。Hermann等[5]在胰腺癌L3.6pl細胞系中分選出占總體比例1%～2%的CD133+亞群，成瘤能力強，表現為103個CD133+即可成瘤，而106個CD133-細胞卻無法成瘤。該亞群能夠在無血清培養基中增殖產生相同表型的子細胞，而在含血清培養基中分化為成熟的腫瘤細胞，表明其具有干細胞特性。Zhou等[7]運用FACS技術在PANC1細胞系中分選出占總體比例約3%的SP細胞，但未進一步研究其自我更新和分化能力。而新近Kabashima等[8]也在PANC1、KP-1NL 和Capan-2等胰腺癌細胞系中分選出不同比例的SP細胞，具有自我更新和分化能力，表現為能夠產生SP和非SP亞群共存的子代細胞。Chambers等[9]應用DNA標記滯留技術在BxPC3和PANC03.27等胰腺癌細胞系中分選出具有干細胞特性的DiI+慢周期細胞亞群(DiI+/SCC)。該亞群不同程度表達CD24、CD44、CD133和ALDH，成瘤能力為DiI-快周期細胞亞群(DiI-/FCC)的10倍。

三、胰腺癌干細胞與侵襲轉移

早期侵襲轉移(即局部進展和全身擴散)是胰腺癌生物學行為的一個重要特征，導致超過75%的胰腺癌患者就診時就失去了根治性手術的機會。經典的侵襲轉移理論認為，這是一個連續的包含多個步驟的過程，需要腫瘤細胞脫離原發瘤并滲入血液或淋巴循環，體內遷徙后黏附到其他部位進而形成微轉移灶和血供，最終形成肉眼可見的轉移灶[9-10]。盡管如此，轉移實際上是一個極為低效的過程，意味著只有極少一部分腫瘤細胞能夠最終形成肉眼可見的轉移灶[11]。Luzzi等[12]研究發現，2%腫瘤細胞能夠形成微轉移灶，但僅0.02%能夠最終形成肉眼可見的轉移灶。Dembinski等[13]運用Transwell侵襲小室實驗發現在BxPC3和PANC03.27細胞系中DiI+/SCC的穿膜細胞數分別是DiI-/FCC 的4和4.5倍，表明具有腫瘤干細胞特性的DiI+/SCC亞群侵襲能力更加顯著。Kabashima等[8]應用肝轉移模型發現在KP-1NL細胞系中103個SP細胞接種后可發生轉移，而5×103個非SP細胞接種后卻無法發生，表明具有腫瘤干細胞特性的SP細胞具有更強的轉移能力。

近年來大量研究表明，上皮-間質轉化(epithelial mesenchymal transformation, EMT)在多種上皮來源的惡性腫瘤侵襲轉移過程中發揮重要作用[14-16]，EMT與腫瘤干細胞的關系也愈來愈受到關注。Kabashima等[8]發現，TGF-β調控的EMT過程主要發生在PANC1和KP-1NL細胞系中的SP細胞中。Dembinski等[13]亦發現，BxPC3及PANC03.27細胞系中DiI+/SCC較DiI-/FCC EMT相關分子snail和E-Cadherin表達降低，而twist、vimentin和N-Cadherin表達升高，表明EMT過程主要發生于DiI+/SCC中，說明腫瘤干細胞更容易發生EMT。

“種子與土壤”與“歸巢”學說是器官特異性腫瘤轉移兩大經典理論，其分子機制以基質細胞衍生因子-1/趨化因子受體軸(SDF-1/CXCR4 axis)研究較為深入[17-20]。SDF-1生物學效應主要包括誘導表達CXCR4細胞的趨化反應和黏附作用，促進金屬基質蛋白酶(MMPs)和血管形成因子的分泌，促進腫瘤細胞的生長和侵襲。Hermann等[5]從L3.6pl細胞系中分選出CD133+CXCR4+和CD133+CXCR4-兩個亞群后發現兩者成瘤能力沒有差異，但僅前者能夠發生肝轉移，且應用CXCR4抑制劑AMD3100后可以顯著減少腫瘤轉移。此外來源于患者癌組織的CD133+亞群CXCR4表達率高者侵襲能力強，腫瘤患者臨床分期晚。該研究首次提出“轉移性腫瘤干細胞”概念，表明其遷移，特別是器官特異性轉移主要通過激活CXCR4實現，從新的角度闡釋了SDF/CXCR4軸在胰腺癌肝轉移中的作用。

四、胰腺癌干細胞與放化療抵抗

放化療抵抗是腫瘤干細胞基本特征之一，原因包括凋亡和DNA損傷抵抗等。多項研究表明，胰腺癌干細胞很可能也對放化療抵抗。Shah等[21]從L3.6pl和AsPC-1細胞系中篩選出吉西他濱抵抗的胰腺癌細胞株，形態和功能上都發生了EMT，且干細胞標志CD44、CD24和ESA表達均顯著增加。Lee等[22]發現放化療能夠富集來源于癌組織的CD44+CD24+ESA+亞群。Hermann等[5]也發現L3.6pl細胞系和癌組織中CD133+亞群較CD133-亞群耐藥更加顯著，且延長化療后前者出現富集現象。同樣，Dembinski等[13]發現5-FU和吉西他濱標準治療后存活的DiI+/SCC在撤去化療藥物后繼續分裂增殖為包含DiI+/SCC和DiI-/FCC的異質性腫瘤細胞。此外， 在成體干細胞和腫瘤中都過度表達的ATP結合盒轉運載體蛋白(ATP-binding cassette proteins, ABCG)可以介導藥物外排進而導致多藥耐藥和SP表型的出現，在腫瘤干細胞的化療抵抗中發揮重要作用[23]。Zhou等[7]發現FACS分選PANC1細胞系后得到的SP細胞中ABCG1與ABCG2的表達水平為非SP細胞的20余倍，進一步證實了上述觀點。

五、胰腺癌干細胞相關信號通路與靶向治療

新近研究證實，胰腺癌干細胞中多種信號通路表達與調控異常，包括SHH、Bmi-1、TGF-β、EGFR等[4,13,22]。Li等[4]發現SHH在胰腺癌細胞、CD44-CD24-ESA-和CD44+CD24+ESA+亞群中的表達水平依次是正常胰腺上皮細胞的4.1、4.0和40.6倍。與此同時，Lee等[22]也發現Bmi-1在正常胰腺上皮細胞和CD44-CD24-ESA-亞群中的表達沒有差異，而在CD44+CD24+ESA+亞群中的表達約為正常胰腺上皮細胞的7倍。此外，Dembinski等[13]觀察到與未分選胰腺癌細胞系相比，DiI+/SCC亞群中TGF-β1表達上調，而EGFR則與之相反。因此，針對胰腺癌干細胞中異常表達與調控的信號通路進行靶向治療具有十分重大的意義。Mueller等[24]聯合應用SHH抑制劑環王巴明、mTOR阻斷劑雷帕霉素和吉西他濱化療使胰腺癌體內與體外模型中的腫瘤干細胞減少至無法檢測的水平，表明傳統化療配合腫瘤干細胞靶向治療極有可能徹底改變胰腺癌患者的預后。

六、問題與展望

胰腺癌干細胞理論從新的角度闡述了胰腺癌的發病機制，為臨床治療提供了新的突破口。胰腺癌干細胞表面標志包括CD44、CD24、ESA、CD133和CXCR4，功能標志包括SP與DiI。這些標志物的產生與干細胞的譜系發育過程及其生物學行為之間的關系尚不明確。應用轉基因及敲基因工程小鼠建立胰腺癌模型，分析不同時期相關標志的表達，有利于明確腫瘤干細胞的動態演變和生物學行為的關系。腫瘤干細胞與非腫瘤干細胞或正常干細胞在基因和蛋白表達譜及相關信號通路表達和調控有何差異還有待進一步研究。倘若我們能夠發現特異性的標志分子或者信號通路，將有助于開發有效的早期檢測方法、精準的靶向治療藥物以及科學合理監測復發和轉移的手段。此外，明確SP細胞在胰腺癌耐藥中發揮的作用，將為未來抗癌藥物的開發與藥效評價提供堅實的理論基礎。

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2010-01-11)

(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.01.027

430022 湖北武漢，華中科技大學附屬協和醫院胰腺外科中心

王春友，Email: chunyouwang52@126.com