毛細(xì)管電泳法測定雷公藤飲片中雷公藤紅素的含量

張 婷

（魯東大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山東 煙臺264025）

雷公藤紅素（celastrol），存在于雷公藤（Tripterygiumwilfordii Hook.F）中。體外藥理實(shí)驗(yàn)證實(shí)雷公藤紅素具有抗炎、抑制腫瘤細(xì)胞增殖等作用，有良好的治療腫瘤的應(yīng)用前景[1,2]。鑒于雷公藤紅素的毒性很大，為了有效控制雷公藤制劑的質(zhì)量，必須建立準(zhǔn)確快速測定雷公藤紅素含量的方法。目前，關(guān)于雷公藤紅素的含量測定，主要是高效液相色譜法（HPLC法）[3,4]。毛細(xì)管電泳法是用于藥物有效成分分離和含測較為有效的一種方法[5,6]，但運(yùn)用毛細(xì)管電色譜分離和測定雷公藤紅素的研究尚未見報(bào)道，本文首次探索了采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳測定雷公藤紅素的方法，方法簡單，時(shí)間快，有較好的應(yīng)用前景。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

HP3DCE毛細(xì)管電泳儀（美國惠普公司，二極管陣列檢測器，檢測波長200～600nm）。

雷公藤紅素（CSL）標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取CSL（本實(shí)驗(yàn)室從雷公藤藥材中分離得到，最后經(jīng)二次重結(jié)晶，經(jīng)HPLC測定，純度大于99%），加適量甲醇溶解，定容于 100mL棕色容量瓶中，配成 2.0×10-3mol·L-1溶液，用時(shí)稀釋到所需濃度；雷公藤飲片（采購于煙臺市毓磺頂大藥房）。

供試品溶液的制備 粉碎適量的雷公藤飲片，過6號藥篩，在80℃干燥2h，至恒重。精密稱取樣品1.000g到5mL的三角瓶中，加適量甲醇，超聲溶解15min后，放置10min，再超聲溶解15min后，放置三角瓶中直到室溫，轉(zhuǎn)移至5mL容量瓶中再加甲醇至刻度，振搖均勻，取3mL溶液超濾后，得到測試溶液；

KH2PO4，K2HPO4，CH3OH，CHCl3等均為分析純，購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水；實(shí)驗(yàn)開始前均用0.45μm濾膜過濾處理緩沖液、對照品溶液和樣品溶液。

1.2 毛細(xì)管電泳分析條件

毛細(xì)管柱：75μm×80.5cm（毛細(xì)管實(shí)際有效長度為 72.5cm，未涂層）；采用 0.05 mol·L-1磷酸鹽（pH值為6.0）-15%甲醇做為電泳分析緩沖液；30kV運(yùn)行電壓；電泳實(shí)驗(yàn)操作溫度：30℃；儀器檢測波長：210nm，根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況對色譜峰面積統(tǒng)一進(jìn)行時(shí)間校正后再處理；正極進(jìn)樣1kPa×5s。樣品分析測試前清洗色譜柱，方法是先用0.1mol·L-1NaOH堿性溶液沖洗色譜柱1min，再用二次蒸餾水沖洗色譜柱1min，最后用實(shí)驗(yàn)選好的緩沖液沖洗2min。在本次實(shí)驗(yàn)中，雷公藤紅素對照品和雷公藤飲片的電泳圖譜見圖1。

圖1 雷公藤紅素對照品（A）和雷公藤飲片樣品（B）的電泳圖譜Fig.1 Capillary electrophoresis chromatograms of chemical reference substance of celestrol(A)and Leigongteng herb drug(B)

1.3 線性關(guān)系的考察

取雷公藤紅素對照品儲備液，準(zhǔn)確量取0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0，2.4，2.8mL，完全轉(zhuǎn)移到 5mL 容量瓶中，容量瓶容積不足的部分用甲醇補(bǔ)足并定容至刻度。取適量樣品，按濃度由低到高的順序依次進(jìn)樣進(jìn)行測量，按照已經(jīng)考察好的電泳條件分別測定8個(gè)對照品溶液的峰面積與遷移時(shí)間的比值，并記錄測定結(jié)果。以峰面積與雷公藤紅素遷移時(shí)間的比值（Y）作縱坐標(biāo)，以雷公藤紅素濃度 X（mg·mL-1）作橫坐標(biāo)，繪制定量分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雷公藤紅素的濃度在0.05～0.40mg·mL-1范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。通過統(tǒng)計(jì)分析，定量分析的回歸方程為：Y=321.41X+1.96，r=0.9990。

1.4 加樣回收率試驗(yàn)

精密吸取已知雷公藤紅素準(zhǔn)確含量的雷公藤飲片樣品5份，分別加入0.20mg·mL-1雷公藤紅素對照品溶液2mL，按照與樣品同樣的實(shí)驗(yàn)方法測定雷公藤紅素含量，然后計(jì)算加樣回收率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，平均加樣回收率為98.94%，RSD為1.72%。

1.5 精密度試驗(yàn)

取濃度為0.20mg·mL-1雷公藤紅素對照品溶液，按照與樣品同樣的實(shí)驗(yàn)方法，重復(fù)測定5次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雷公藤紅素峰面積RSD為1.12%。

1.6 含量測定

共測定了3批樣品，結(jié)果見表1。

表1 樣品中延雷公藤紅素含測結(jié)果Tab.1 Determination results of celestrol in Leigongteng herb drug

2 結(jié)果與討論

2.1 緩沖液pH值對雷公藤紅素分離的影響

雷公藤紅素是三萜類成分，分子中含有酚羥基，在水溶液中的荷電性容易隨溶液的pH值的不同而存在不同的分子荷電性，當(dāng)緩沖溶液的pH值小于7時(shí)，雷公藤紅素以傾向于以中性分子形式存在，根據(jù)毛細(xì)管電泳理論，不同的組分是依據(jù)電滲進(jìn)行分離的，中性組分之間在毛細(xì)管區(qū)帶電泳模式下難以實(shí)現(xiàn)分離，往往同時(shí)出峰，因此雷公藤紅素會與樣品中的其它中性組分在譜圖上有十分相近的出峰時(shí)間，難以實(shí)現(xiàn)定性和定量分析（如圖2中A）。隨著緩沖液pH升高，雷公藤紅素由中性分子向荷電離子轉(zhuǎn)變，逐步實(shí)現(xiàn)了與樣品中含有的中性組分達(dá)到分離的目的。

圖2 緩沖液pH值的影響Fig.2 Effect of pH of buffer solution

由圖2可以看出，當(dāng)pH值大于7時(shí)，雷公藤紅素以陽離子形式存在，與其他中性組分形成了基線分離，達(dá)到了定量分析的要求。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH值為8.0時(shí)，雷公藤紅素分析時(shí)間短，分離效果好，所以本實(shí)驗(yàn)選擇緩沖液pH值為8.0。

2.2 甲醇用量對雷公藤紅素分離的影響

通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，緩沖液中甲醇含量的多少直接影響樣品液中雷公藤紅素與其它雜質(zhì)峰的分離效果，見圖3。

圖3 甲醇用量的影響Fig.3 Effect of methanol

如果不加甲醇，雷公藤紅素與其它組分混在一起出峰，達(dá)不到基線分離的要求，當(dāng)甲醇在緩沖溶液中的體積百分比超過達(dá)到10%時(shí)，可明顯改善雷公藤紅素可與相鄰色譜峰的分離效果，并實(shí)現(xiàn)基線分離。但是并非甲醇的量越多越好，因?yàn)榧尤爰状嫉耐瑫r(shí)也會降低電滲流，這樣就會延長組分出峰時(shí)間，使分析工作的時(shí)間延長，綜合考慮分離效果和分析時(shí)間，本實(shí)驗(yàn)選擇甲醇體積百分比為15%。

2.3 同存成分的干擾

雷公藤藥材中的三萜類化學(xué)成分很多，且性質(zhì)相近，由于常規(guī)色譜分析是依據(jù)組分的極性進(jìn)行分離，分析結(jié)構(gòu)、極性相近的組分有一定困難，而本實(shí)驗(yàn)采用毛細(xì)管電泳法，利用分子的荷電性進(jìn)行分離，樣品譜圖中大部分峰呈基線分離，峰形較好，從而保證了目標(biāo)成分測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)首次運(yùn)用毛細(xì)管區(qū)帶電泳法對雷公藤中藥材中的有效成分雷公藤紅素進(jìn)行了定性定量分析，方法重現(xiàn)性好，分析時(shí)間短，能有效地實(shí)現(xiàn)各組分的分離，有效避免了其它組分的干擾，可以和其它方法一起做為雷公藤紅素成分的分析方法，相互補(bǔ)充，可以適用于含雷公藤紅素的中藥制劑的分析測定。

［1］Chang FR,Hayashi K,Chen IH,et al.Antitumor agents.228.five new agarofurans,Reissantins A-E,and cytotoxic principles from Reissantia buchananii［J］.J.Nat.Prod，2003,66（11）:1416-1420.

［2］Yang H J,Chen D,Cui Q C,et al.Celastrol,a triterpene extracted from the Chinese"Thunder of God Vine,"is a potent proteasome inhibitor and suppresses human prostate cancer growth in nude mice［J］.Cancer Res.,2006,66（9）:4758-4765.

［3］夏焱,王文燕,張彥文.高效液相色譜法測定雷公藤類藥材及其制劑中雷公藤紅素的含量［J］.中草藥,2005,36（8）:1154-1156.

［4］吳霞,黃文華,郭寶林.雷公藤制劑中雷公藤紅素的含量研究［J］.中國中藥雜志，2009,34（7）:836-838.

［5］陳振泉,李英杰.天冬氨酸-β-環(huán)糊精在毛細(xì)管電泳中拆分手性藥物羅格列酮［J］.化學(xué)工程師，2007,（10）:55-56；59.

［6］陳治春,陳世界,李英杰.羧甲基聚合-β-環(huán)糊精在毛細(xì)管電泳中分離酪氨酸對映體［J］.化學(xué)工程師，2006,（11）:4-5.