銀杏黃酮提取和精制工藝的研究

韓學哲，王東雙，安曉東，連運河

(1.河北省天然色素工程技術研究中心，河北 邯鄲 057250；2.晨光生物科技集團股份有限公司，河北 邯鄲 057250)

銀杏葉提取物(Ginkgo Biloba Extract)的主要含有是銀杏黃酮和內酯兩大活性成分[1]，其中銀杏黃酮有效成分包括：銀杏雙黃酮 (gilobetin)、白果素(bilobetin)、槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)等都具有3,3,4-三羥基結構的物質[2]，具有抗氧化、降血脂、抗腫瘤等方面的作用[3]。鑒于銀杏葉中黃酮具有獨特的生理作用、臨床治療和保健價值[4]，使GBE及其制劑一直為國際國內研究開發的熱點之一[5]。目前，銀杏葉中銀杏黃酮的得率不高,生產消耗較大,對滿足市場需求不利,因此，不斷探索銀杏葉中黃酮新的提取、精制工藝，提高得率，降低成本，以達到節能增效的目的,具有很現實的意義。本研究旨在通過實驗研究,篩選最佳工藝,提高黃酮得率,降低生產成本。

本文應用循環提取工藝對銀杏葉整葉進行提取，確定了提取溫度、提取遍數和固液比。并對銀杏黃酮精制工藝進行了研究，進行了大孔樹脂篩選實驗，研究了上柱液的pH值和洗脫液對黃酮得率的影響，最終確定了最佳的銀杏黃酮的提取和精制的工藝條件。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

Agilentl200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)。

銀杏葉(從山東郯城收購)；乙醇(食品級)，其他試劑均為分析純。槲皮素，山萘酚,異鼠李素對照品均購于上海同田生物技術有限公司。

1.2 檢測方法[6-8]

色譜條件與系統適用性試驗：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，甲醇-0.4%磷酸溶液(50∶50)為流動相，檢測波長為360nm。理論塔板數按槲皮素峰計算應不低于2500。

溶液制備：分別精密稱取經P2O5干燥過夜的槲皮素、山柰素、異鼠李素對照品，加甲醇制成每1mL分別含0.0299，0.0387，0.015mg的溶液，作為對照品溶液。精密稱取固體樣品0.05g，液體樣品吸取樣品2mL蒸干，將固體樣品或者液體樣品殘渣加甲醇-25%鹽酸溶液 (4∶1)混合液25mL溶解，移入250mL燒瓶中，回流30min，冷卻，轉移至50mL量瓶中，以甲醇定容，搖勻，濾過，即得供試品溶液。

測定法：分別精密吸取上述對照品溶液與供試品溶液，注入液相色譜儀，測定，分別計算3種黃酮苷元的含量，以下式換算成總黃酮醇苷的含量。總黃酮醇苷含量=(槲皮素含量+山柰素含量+異鼠李素含量)×2.51。

1.3 銀杏黃酮的提取工藝過程

2 結果與討論

目前，對銀杏葉中黃酮類化合物的提取,廣泛使用的以乙醇-水溶液(70%乙醇)和純水為浸取溶劑進行生產。結果表明：1次浸取2 h，計算黃酮類化合物的浸出率，乙醇-水體系高于水體系。綜合考慮能耗和得率成本，故本實驗選70%乙醇作為浸取溶劑。

2.1 提取溫度對提取效果的影響

在提取固液比1∶5，提取1次，提取時間2h條件下，選取溫度 80 、70 、65 、55、45℃的條件,考察溫度對銀杏葉中總黃酮提取率的影響,不同溫度下提取結果見表1。

表1 溫度對黃酮提取率的影響Tab.1 Effect of temperature to extraction ratio of flavone

由表1數據可以看出，溫度升高，提取率增大，當提取溫度在65℃和70℃時，浸出率僅差0.3%，溫度再升高提取率反而有所下降。這是由于銀杏黃酮苷的分子結構中，存在多個酚羥基，酚羥基性質很不穩定，在溫度較高時易被空氣氧化所致，故選擇浸取溫度65℃為宜。

2.2 提取遍數對提取效果的影響

在提取每遍固液比1∶5，提取5遍，提取時間2h條件下，考察提取遍數對銀杏葉中總黃酮提取率的影響，結果見表2。

表2 提取遍數對黃酮提取率的影響Tab.2 Effect of extraction times to extraction ratio of flavone

由表2數據可以看出，提取遍數增多，提取率增大，當提取遍數在第4遍時，浸出率1.5%，第5遍和第4遍相差0.4%，提取遍數再增多浸出率沒有增長太多，考慮到生產成本，故選擇提取遍數3遍為宜。

2.3 固液比對提取效果的影響

在提取3遍，提取時間3h，提取溫度65℃條件下，選取總固液比 1∶9，1∶15，1∶18 的條件,考察固液比對提取銀杏葉中總黃酮含量的影響,以考察提取完的渣中的含量檢測提取率，結果見表3。

表3 固液比對黃酮提取率的影響Tab.3 Effect of solid-to-liquid ratio to extraction ratio of flavone

由表3數據可以看出，總固液比增大，提取率增大，當浸取總固液比在1∶15和1∶18時，渣中含量相差0.02%，浸出率僅差0.2%，固液比增大提取率也增長不明顯，考慮到生產成本，因此，總固液比選擇1∶15。

2.4 溶劑逆流循環提取對提取效果的影響

由于提取過程中第2遍和第3遍的提取液遠沒有達到飽和，因此，設計將溶劑逆流循環使用，固液比：第 1 遍 1∶5、第 2 遍 1∶5、第 3 遍 1∶5，將第一輪的第2遍萃取液作為第二輪的第1遍使用，第二輪的第3遍和作為第二輪第2遍，第3遍使用新溶劑，然后第二輪的第2遍萃取液作為第三輪的第1遍使用，這樣依次循環下來，保證提取溶劑每次提取溶劑都達到飽和，并且濃縮時只濃縮第1遍料液，減少了濃縮量，降低了生產消耗；提取溫度為65℃，時間為每遍2h。考察逆流循環提取的效果見表4。

表4 循環提取工藝銀杏黃酮的提取率Tab.4 Extraction ratio of flavone by extraction process cycling

由表4數據可以看出，逆流循環提取，提取溶劑能達到飽和，提取率達到非循環提取效果，并且溶劑使用量、濃縮量較非循環提取能減少三分之二。

2.5 樹脂選擇

選擇樹脂需要考察樹脂的分離效果和產品的含量兩項指標才能確定樹脂的使用，因此，選擇了5種樹脂：AB-8、LX-38、D101、LXA-8、HZ-841，進行實驗，實驗結果見表5。

表5 不同樹脂的產品含量和得率Tab.5 Content and yield of different resin production

由于目前市場上銀杏產品黃酮含量大于24%，因此，選擇D101作為下步實驗用樹脂。

D101樹脂的動態吸附效果見圖1。

圖1 D101樹脂對銀杏黃酮的動態吸附效果Fig.1 Dynamic adsorption effect of D101 resin to ginkgetin

配銀杏黃酮濃度為3mg·mL-1的溶液，吸附流速為2BV·h-1，處理11BV的料液，每處理1BV的物料液收集一次流出液并用液相檢測銀杏黃酮的含量。從圖1中可知，3個樹脂床體積氣有泄漏，未達到飽和之前，吸附柱內被吸附的銀杏黃酮的濃度由上至下梯度降低，因而采用串聯吸附方式，可以使樹脂的吸附性能得到最大限度的發揮利用。

2.6 上樣液pH值對D101樹脂吸附效果的影響

取一定量的原液，分別調 pH 值為 4、4.5、5、5.5、6，控制流速為1BV·h-1，收集流出液并測量，以TLC板標定終點，計算吸附量。見圖2，當pH值為5時，樹脂的吸附能力最大。

圖2 上樣液pH值對樹脂吸附效果的影響Fig.2 Effect of pH of gel loading buffer to adsorption of resin

2.7 洗脫液對銀杏黃酮得率的影響

分別稱取定量被銀杏黃酮飽和的D101樹脂，各加入6BV甲醇、乙醇、丙酮，靜態洗脫4h，取上清液，測定其中銀杏黃酮的濃度并換算成得率，結果見表6。

表6 洗脫劑對黃酮得率的影響Tab.6 Effect of eluant to flavone yield

從表6中可知，甲醇和乙醇的得率相差不大，考慮到甲醇的毒性，選用乙醇作為洗脫劑。

3 結論

本文通過乙醇提取銀杏葉中銀杏黃酮，并對醇提工藝的條件進行了優化。最佳工藝為：提取溶劑為70%的乙醇，提取溫度65℃，固液比為1∶5，提取3遍，濃縮后調pH值為5，過D101大孔樹脂柱，乙醇解析可得到含量為24%的精制銀杏黃酮。

本研究采用了循環提取的工藝大大減少了溶劑的使用量，降低了生產成本，適合工業化生產。對提取溫度、提取次數對提取率的影響做了較為詳細的分析，對工業化生產有著指導意義。整個工藝過程操作簡便，使用的溶劑對環境無污染，成本低，適合工業化生產。

［1］何琦,及元喬,丁立生，等.D140大孔吸附樹脂銀杏黃酮提取純化性能研究［J］.天然產物的研究與開發,2001,13（1）：56.

［2］肖順昌，等.銀杏葉黃酮制備工藝研究［J］.中國醫藥工業雜志,1990,21（5）：340.

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［4］李兆龍.銀杏葉開發利用［M］.上海科技文獻出版社，1996.3-4.

［5］劉桂霞,孫玉偉,金兆祥.銀杏葉的研究進展［J］.國外醫藥（植物藥分冊）,1994,9（1）:10.

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