幾種處理方法對雞精液冷凍保存效果的影響*

胡艷娟 陳 峰, 李 莉 梁國雄 張守全 (華南農業大學動物科學學院 廣州 5064廣東省溫氏食品集團 廣東新興 57439)

幾種處理方法對雞精液冷凍保存效果的影響*

胡艷娟1陳 峰1,2李 莉1梁國雄2張守全1(1華南農業大學動物科學學院 廣州 5106422廣東省溫氏食品集團 廣東新興 527439)

本文從冷凍保存主要環節的幾種處理方法對雞精液冷凍保存的效果進行了探討，結果顯示：采用液氮熏蒸法的凍后活力和復蘇率均顯著高于直接投入液氮法；采用細管冷凍的凍后活力和復蘇率均顯著高于顆粒冷凍；采用兩步稀釋法的凍后活力和復蘇率均顯著高于一步稀釋；精液平衡0.5h、1h、2h精子凍后活力和復蘇率均差異不顯著；熏蒸時間為10min的凍后活力和復蘇率均顯著高于5min，且略高于15min但差異不顯著；37～40℃解凍后精子活力和復蘇率顯著高于20～25℃，但與55～60℃差異不顯著。

雞精液 冷凍保存 精子活力 復蘇率

雞精液冷凍技術對于最大限度地利用遺傳性能優秀的種公雞，有效地保護許多瀕臨滅絕的地方品種，保持雞遺傳資源的多樣性等有著重要的意義。但是雞精液冷凍技術尚處于實驗階段，各種冷凍方法都有待于進一步提高。本實驗希望探索出一套優良的冷凍保存工藝，以優化雞精液冷凍保存程序，提高冷凍保存后精子活力和復蘇率。

1 材料與方法

1.1 試驗材料：本試驗公雞精液采自廣東省廣州市華南農業大學種雞場的粵黃雞。

1.2 稀釋液配方：5%葡萄糖液為基礎液，添加13%甘油和15%新鮮卵黃為冷凍保存終溶液。

1.3 精液稀釋與平衡：比較2種方法，（1）一步稀釋：直接用含冷凍保護劑的冷凍終溶液1∶1稀釋，置于4℃冰箱，平衡待用。（2）兩步稀釋：第一步先用不含冷凍保護劑的基礎液1∶1稀釋，然后置于4℃冰箱1h；第二步再以1∶1比例將含冷凍保護劑的冷凍保存終溶液（先前已置于4℃冰箱預冷）加入到第一步已稀釋的精液中，輕輕混勻后置于4℃冰箱平衡待用。

1.4 精液的冷凍：比較顆粒冷凍法與細管冷凍法。

顆粒冷凍方法如下：（1）液氮熏蒸法：將保溫瓶里裝2/3的液氮，在液氮面上放置一鋁盒預冷，然后用吸管取平衡好的稀釋精液滴在鋁盒上熏蒸（每個顆粒劑量0.2mL），熏蒸完后將顆粒浸入液氮保存。（2）直接投入液氮法：將保溫瓶里裝2/3的液氮，然后直接用吸管取平衡好的稀釋精液滴在液氮里冷凍。

細管冷凍方法如下：將平衡后的精液取出，用吸管將精液吸入0.25mL的牛用凍精細管里，封口。將保溫瓶里裝2/3的液氮，在液氮面上方2～3cm處架上一層塑料管支撐的網，然后將做好的細管水平放在塑料網上熏蒸，熏蒸完后浸入液氮保存。

2 結果與分析

2.1 冷凍速度對凍精活力的影響：

表1 顆粒冷凍不同滴凍方法的比較

由表1可以得出：采用液氮熏蒸法的凍后活力和復蘇率均顯著高于直接投入液氮法，說明太快的冷凍速度不利于精子的保存。

2.2顆粒冷凍與細管冷凍對凍精活力的影響：由表2可以看出，采用細管冷凍的凍后活力和復蘇率均顯著高于顆粒冷凍，表明采用細管冷凍法的效果明顯優于顆粒冷凍法。

2.3 稀釋方法對凍精活力的影響：由表3可以看出，采用兩步稀釋法的凍后活力和復蘇率均顯著高于一步稀釋，表明采用兩步稀釋法的效果明顯優于一步稀釋法。

2.4 平衡時間對凍精活力的影響：由表4可以看出，平衡0.5h、1h和2h的凍后活力及復蘇率均差異不顯著，表明不同平衡時間對冷凍效果影響不大。

2.5 熏蒸時間對凍精活力的影響：由表5可以看出，熏蒸時間為10min的凍后活力和復蘇率均顯著高于5min，且略高于15min試驗組，但差異不顯著；5min試驗組與15min試驗組之間差異不顯著，表明熏蒸時間采用10min的效果好。

2.6 解凍溫度對凍精活力的影響：由表6可以看出，解凍溫度為37～40℃的凍后活力和復蘇率均顯著高于20～25℃，且略高于55～60℃，但差異不顯著，20～25℃與55～60℃之間差異不顯著，表明解凍溫度采用37～40℃最好。

3 討論

3.1 關于凍精類型的選擇：目前凍精的類型主要有顆粒型凍精與細管型凍精。對于牛、羊等射精量較小的家畜冷凍精液，目前普遍使用0.25mL的微型細管。因為0.25mL的微型細管直徑小、管壁薄，在冷凍制作過程中受凍均勻，活力提高，促進受胎率提高（吳結革等，2003）。但是微型細管容量小、裝精液少，不適合用于馬、豬等輸精量較大的家畜。而顆粒凍精單個顆粒內有效精子數少，但它具有體積小，能充分利用冷凍貯存設備，冷凍方便，精液利用率高等優點。若要克服其有效精子數不足的弱點，只要增加每次輸精的顆粒數即可。參考以上資料，本實驗選取了0.25mL的細管凍精和0.2mL的顆粒凍精進行比較，結果顯示同種稀釋液細管凍精的凍后活率和復蘇率顯著高于顆粒凍精。可能是因為0.25mL的微型細管管壁薄且直徑小，在冷凍制作過程中受凍均勻，能較好地保護精子免受損害，提高精子活力。雖然微型細管容量小，但由于雞輸精量少，所以雞精液用細管凍存應該還是有較強適用性的。

表2 顆粒冷凍與細管冷凍的比較

表3 不同稀釋方法對冷凍精液活力的影響

表4 平衡時間對冷凍精液活力的影響

表5 熏蒸時間對冷凍精液活力的影響

表6 解凍溫度對冷凍精液活力的影響

3.2 關于冷凍速度的控制：冷凍過程中的精子細胞不但要對保存溫度（-196℃）有耐受能力，而且要能經受從射精時機體溫度到保存時超低溫度的變化而活力不會過度降低，后者比前者更顯得重要（馬金霞等，2004）。而過快的降溫速度會使得結晶速度超過細胞內水分逸出的速度，導致細胞在脫水前，其體內已經結冰，從而造成細胞內冰晶的機械損傷。基于此，本實驗進行了液氮熏蒸法和直接投入液氮法的比較，結果顯示，采用液氮熏蒸法的精子活力和復蘇率明顯高于直接投入液氮法。原因就是液氮熏蒸法使得精子由機體的較高溫度降低到超低溫度的過程不會太快，增強了精子對溫度變化的耐受能力；而直接投入液氮法因為降溫速度太快導致了精子內部形成冰晶而損傷，從而降低了活力。另外，關于熏蒸時間的長短，本實驗中，熏蒸時間為10min的效果最佳，優于5min和15min，表明熏蒸時間要適中，不宜太短和太長。

3.3 關于精液的稀釋方法：本實驗進行了一步稀釋法和兩步稀釋法保存效果的比較，結果顯示：兩步稀釋法的效果明顯優于一步稀釋法。主要原因就是：根據研究報道，在常溫下，甘油會損傷精子頂體和頸部，造成尾部彎曲，破壞某些酶類，從而影響受精率（劉建忠等，2005；王洪亮等，2005）。Ogasawara等（1997）報道在凍前向鮮精加甘油稀釋液，會使細胞膜松弛，并產生線粒體膨脹。另有研究表明，在3～5℃時添加甘油可以保持更高的解凍后活力（Mathur et al，1989），所以通常在降溫到3～5℃時使用甘油。而兩步稀釋法就是因為先用不含保護劑的稀釋液稀釋精液并慢慢降溫至4℃，然后再加入4℃預冷的保護劑進行平衡。這樣就可以避免甘油直接作用于鮮精，減少常溫下甘油對精子作用的時間從而降低甘油對精子的損害。

3.4 關于冷凍前的平衡時間：精液經稀釋后要有一個緩慢降溫的過程，特別是降到22℃以下時，精子低溫打擊比22℃以上時更為敏感。添加保護劑后的稀釋精液，要置于4℃經過一定時間的放置，這個放置時間就是平衡時間。平衡是為了使甘油等冷凍保護劑滲入精子體內，產生抗凍保護作用。由于稀釋液、防凍劑以及試驗方法等各不相同，冷凍前的平衡時間也不一致。Mitchell等（1948）比較了以DMSO作冷凍保護劑時不同平衡時間（15～105min）對冷凍效果的影響，結果表明DMSO不同的平衡時間的冷凍效果沒有差異；而Sexton（1977）的研究表明，加DMSO后平衡2h的效果明顯優于不平衡（0h）和平衡時間過長（4h、6h）的效果。本實驗比較了平衡0.5h、1h和2h后冷凍保存的效果，結果顯示，這3個平衡時間凍后精子活力和復蘇率差異均不顯著，表明平衡時間的長短對冷凍保存效果沒有明顯影響。

3.5 關于凍精解凍溫度的選擇：無論是冷凍還是解凍都要求在較短時間內越過危險溫區（0～60℃），避免低溫對精細胞的損傷。本試驗結果顯示，細管凍精在37～40℃水浴中解凍效果明顯優于20～25℃水浴中解凍，但與55～60℃水浴中解凍效果差異不顯著。這可能是由于20～25℃解凍，冷凍精液升溫較慢，精子不能安全通過危險溫區，造成損傷比較大，這表明在防止冰晶形成過程中，較高溫度和較快的解凍速率對精子損傷小，有利于解凍后雞精子的存活。雖然55～60℃解凍效果與37～40℃差異不顯著，但由于55～60℃溫度較高，不易控制，所以認為解凍溫度以37～40℃為宜。

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S831.4

A

1008-3847(2011)06-0006-03

*本項目由廣東溫氏食品集團提供資助

張守全，sqzhang@scau.edu.cn

羅慶斌