上肢精準測試系統在食蟹猴腦缺血研究中的應用

朱 華，劉 穎，李 秦，盧 珊，馮 銘，肖 沖，安沂華，趙春華，王任直，秦 川

（1.中國醫學科學院北京協和醫學院比較醫學中心，衛生部比較醫學重點實驗室，北京 100021； 2.中國醫學科學院實驗動物研究所Motac合作實驗室，北京 100050；3.中國醫學科學院北京

協和醫院，北京 100073；4.中國醫學科學院基礎醫學研究所，北京 100005； 5.北京神經外科研究所，北京 100050）

動物模型是研究缺血性腦卒中損傷機制、對神經保護劑療效作出判斷必不可少的工具。嚙齒類動物大腦與人的大腦有許多不同，對于相同缺血損傷的反應可能不同。因此，難以明確怎樣將動物的給藥方案擴大到人體。非人靈長類在種屬關系上較接近于人，腦血管的解剖學特點與人類似，更應引起研究者注意的是非人靈長類可技巧性的使用四肢完成運動任務。利用這些特點制備的靈長類缺血性腦卒中動物模型用于評價干細胞等神經保護劑的效果，不僅可以從組織病理學及影像學方面，更可通過較系統的行為學分析評價其療效。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

成年雄性食蟹猴18只［SCXK-（京）2005-005］，購自協爾鑫生物資源研究所，年齡4～6歲，體重4.2～4.5 kg。

1.2 主要儀器及試劑

精準上肢測試系統：透明樹脂板上嵌有食槽，每次訓練及采集數據時將該裝置懸掛于猴籠正面。

1.3 腦缺血模型的制作

使用光化學法制作局部腦缺血模型。具體方法見參考文獻［1］。

1.4 干細胞移植

1.4.1 動物及分組：18只動物分為模型對照組、高劑量組、低劑量組，分組的原則是各組動物間體重差異沒有顯著性。各組劑量（表1）。

1.4.2 細胞注射：細胞為250μL的無色懸液，5個移植途徑，每個移植途徑50μL。進針深度9 mm。每次注射完畢留針 1 min。移植速度50μL/min。對照組注射等體積生理鹽水。注射途徑、速度、進針深度與劑量組相同。

1.5 行為學數據采集

1.5.1 前期訓練：首先使動物消除恐懼心理，誘導動物能從實驗者手中抓取水果塊。與動物建立感情后，掛上實驗裝置，將水果塊置于食槽中央。逐步引導動物從投食處取食。每天上、下午固定時間各進行1次。訓練期間每日喂食改為1次，每次30 g，訓練結束后給與。保證飲水。訓練期間監控動物體重，根據體重調整喂食量。

表1 動物分組Tab.1 Grouping of the animals

1.5.2 數據采集：所有動物從實驗裝置中取食狀況穩定后進行本底數據采集。方法：將蘋果切成2 cm ×2 cm×2 cm大小，擺放在食槽中央，每次5塊。用秒表記錄動物動物將5塊水果全部取走的時間。每次數據的采集在1 d內完成，共5次，每次間隔2 h。每次采集時，水果塊的大小、形狀及擺放位置要一致。造模后1 d、3 d、1、2、3、4周及干細胞注射后1 d、3 d、1、2、3、4、5、6、8周采集實驗數據，方法及采集時間與采集本底數據時相同。比較造模前后動物受損傷側上肢抓取水果塊的時間，評價造模效果。比較干細胞注射前后動物受損傷側上肢抓取水果塊的時間，評價干細胞的治療效果。

1.5.3 神經功能評分：造模后1 d、3 d、1、2、3、4周及干細胞注射后1 d、3 d、1、2、3、4、5、6、8周使用經過修改、細化的Kito靈長類動物神經功能損害評分表對模型動物進行神經功能評分，其中意識28分，感覺系統22分，運動系統32分，骨骼肌共濟協調18分共100分［6］。

1.5.4 數據處理：使用SPSS13.0軟件進行數據分析，統計方法采用相關性分析，單因素方差分析，P值小于0.05時認為差異有顯著性。

2 結果

2.1 模型制作

18只動物在麻醉蘇醒后均出現了與梗死部位相對應的神經系統定位體征。主要表現為動物蘇醒后6 h內表現為有意識但情緒低落，對疼痛和聲音刺激不反抗。骨骼肌出現共濟失調。受損傷側上肢出現明顯的麻痹，不能抓握。跛行。術后3 d部分動物的抓握能力有所恢復，但在采集數據的各個時間點，動物受損傷側上肢抓取水果塊的時間與手術前差異均存在極顯著性 （P＜0.01）（表2）。神經功能評分在術后24 h最高，隨后出現漸進性恢復（表3）。

2.2 干細胞治療

干細胞治療后1 d，動物的行為學表現已出現好轉，但與對照組比較差異無顯著性。從治療后3 d開始到治療后第8周，模型組動物與高低劑量組動物間在抓取水果塊的時間上差異均存在顯著性 （P＜0.05）（表4）。神經功能評分在治療2周后差異出現顯著性（P＜0.05）（表5）。高、低劑量組間差異未見顯著性。

表2 手術前后動物抓取水果塊時間的比較（s；±s；n=18） Tab.2 Comparison of the times at that the animals pick up the food before and after surgery

表2 手術前后動物抓取水果塊時間的比較（s；±s；n=18） Tab.2 Comparison of the times at that the animals pick up the food before and after surgery

Note：＊＊P＜0.01，手術前，B.S：before surgery；手術后，A.S：after surgery.

時間Time術前B.S術后24 h 24 hrs A.S術后3 d 3 d A.S術后1周1 wk A.S術后2周2 wks A.S術后3周3 wks A.S術后4周4 wks A.S左手upper left hand 13.4±1.82 150.9±16.27＊＊105.1±10.73＊＊ 87.5±8.96＊＊ 64.9±17.09＊＊ 58.1±12.82＊＊ 48.4±8.40＊＊

表3 手術前后神經功能評分結果 n=18Tab.3 Comparison of neurological deficit scores before and after surgery

表4 干細胞治療前后動物抓取水果塊時間的比較（s；±s；n=6） Tab.4 Comparison of the times at that the animals pick up the food before and after stem cell transplantation

表4 干細胞治療前后動物抓取水果塊時間的比較（s；±s；n=6） Tab.4 Comparison of the times at that the animals pick up the food before and after stem cell transplantation

Note：*P＜0.05，手術前，B.S：before surgery；手術后，A.S：after surgery；A.T：after stem cell transplantation.

組別Group時間Time術前B.S術后24 h 24 h A.S術后4周4 wks A.S移植1天1 d A.T移植3天3 ds A.T移植1周1 wk A.T模型組Control 12.4±2.71 160.3±9.19 50.6±9.65 46.8±11.56 44.3±15.75 48.2±13.72高劑量組High dose 14.0±6.90 155.5±20.37 47.0±6.45 34.4±17.17 18.6±2.98* 17.7±6.18*低劑量組Low dose 13.3±1.97 140.7±24.34 49.3±10.64 32.4±12.89 23.4±8.32* 21.9±5.59*組別Group時間Time移植2周2 wks A.T移植3周3 wks A.T移植4周4 wks A.T移植5周5 wks A.T移植6周6 wks A.T移植8周8 wks A.T模型組Control 42.1±17.48 46.5±7.49 41.5±2.69 49.0±3.39 46.6±14.99 46.5±15.98高劑量組High dose 19.1±5.86* 27.8±16.94* 25.3±14.61* 27.1±15.40* 22.2±6.93* 22.8±6.35*低劑量組Low dose 23.6±6.12* 22.2±1.60* 15.7±1.81* 20.8±0.72* 18.7±1.94* 20.0±5.90*

表5 干細胞治療前后神經功能評分結果（n=6） Tab.5 Comparison of neurological deficit scores before and after stem cell transplantation

3 討論

對實驗動物缺血損傷后的行為做出評價是與人類卒中后臨床表現特點緊密相關的。1999年在美國福羅里達州召開的STAIR卒中會議制訂了六條評價腦卒中新藥的標準，其中第四條強調了神經功能測評的重要性。目前在對神經保護劑的療效進行評價時，研究者們的注意力大多放在缺血后的病理改變上。但早在1986年，Bothe等就已經發現了“隱蔽損傷”現象［2］，即缺血損傷后有時盡管組織病理表現是接近正常甚至是正常的，但已存在功能異常。此時，以缺血面積或細胞的喪失程度做為評價標準顯然是不可靠的。因而缺血損傷后行為學檢查所顯示的功能異常成為確定神經元早期死亡的唯一手段。

目前用于非人靈長類的神經行為評價方法主要有兩種：量表法和通過完成任務來測試動物腦缺血損傷后的運動損害、認知障礙、肢體力量及精細運動功能等。專門為猴卒中設計的量表包括卒中臨床等級評價量表［3］、標準神經評定量表［4，5］、猴栓塞后神經缺陷評價量表等［6］，其中的猴栓塞后神經缺陷評價量表即我們采用的kito量表。這個量表專門針對神經系統損傷而設計，與臨床卒中病人采用的量表類似。通過完成任務來測試非人靈長類神經功能的方法主要有：抓取食物丸任務［7，8］，主要用于評價手的靈巧度；山和谷階梯任務［9］，主要用于鑒別運動損害與視覺空間缺陷。精細運動測試主要用于評價肢體力量和精細運動功能，符合本實驗的要求。因此采用這種測試方法評價模型動物的神經功能。

用量表對靈長類的神經功能進行評價的優點是比較直觀，可分系統對神經功能進行評價，不需要對動物進行訓練。但要求評價者有較豐富的經驗，不同的人對同一動物進行評價其結果可能相差較多。精細上肢運動測試方法在實驗正式開始前需要花費大量時間對動物進行訓練，動物一旦掌握了抓取食物的方法，即可通過時間上的差異對動物手術前后及注射干細胞后的療效進行比較客觀的評價。

我們對文獻報道的精細上肢運動測試系統進行了改造，使測試板配有樹脂玻璃限制，只有被評價的上肢能接近，通過記錄動物取出全部水果塊的時間可提供關于肢體力量、精細運動功能方面的全部信息。實驗結果顯示，食蟹猴光化學法造模后出現了明顯的行為學癥狀。隨著時間推移癥狀有所減輕，2周左右神經功能評分和精細上肢運動測試都達到穩定狀態。表明模型建立方法是穩定可靠的。劑量組行為學在注射干細胞后3 d開始改善。神經功能評分和精細上肢運動測試分別在注射后2周和1周出現顯著性差異。在今后的實驗中，可通過2名有經驗的人員分別進行評價，取二者平均值的方法減少量表評價法的主觀性。

綜上所述，上肢精準測試系統雖然在實驗前需要做較多的準備工作，但因其能客觀準確的反應動物神經功能，結合神經功能評分，在非人靈長類腦卒中動物模型建立和藥效學評價方面有廣泛的應用前景。

［1］朱華，李秦，馮銘，等.光化學法制作食蟹猴局部腦缺血模型［J］.中國比較醫學雜志，2008，18（9）：32-34.

［2］Bothe HW，Bosma HJ，Hofer H，et al.Selective vulnerability of hippocampus and disturbances ofmemory storage after mild unilateral ischermia of gerbil brain［J］.Stroke，1986，17：1160-1163.

［3］Ben R，Naimath K，Eray T，et al.Chronic ischemic stroke model in cynomolgus monkeys：behavioral，neuroimaging and anatomical study［J］.Neurol Res，2003，25（1）：68-78.

［4］Huang J，Mocco J，Choudhri TF，et al.A modified transorbital baboon model of reperfused stroke editorial comment［J］.Stroke，2000，31（12）：3054-3063.

［5］Mack WJ，King RG，Hoh DJ，et al.An improved functional neurological examination for use in nonhuman primate studies of focal reperfused cerebral ischemia［J］.Neurol Res，2003，25 （3）：280-288.

［6］Kito G，Nishimura A，Susumu T，et al.Experimental thromboembolic stroke in cynomolgus monkey［J］.J Neurosci Methods，2001，105（1）：45-53.

［7］Yonas H，Wolfson SK，Dujovny JM，et al.Selective lenticulostriate occlusion in the primate.A highly focal cerebral ischemiamodel［J］.Stroke，1981，12（5）：567-572.

［8］Marshall JW，Ridley RM，Baker HF，et al.Serial MRI functional recovery and long term infarct maturation in a non human primate model of stroke［J］.Brain Res Bull，2003，61 （6）：577-585.

［9］Marshall JW，Ridley RM.Assessment of cognitive and motor deficits in a marmosetmodel of stroke［J］.ILAR J，2003，44 （2）：153-160.