人參SQE基因干擾載體的構建及轉化

于彥婷，任麗，孫春玉，蔣世翠，王義，張美萍

人參SQE基因干擾載體的構建及轉化

于彥婷，任麗，孫春玉，蔣世翠，王義，張美萍

目的探討SQE基因對人參皂苷合成的影響。

方法根據SQE基因保守區序列，分別設計合成其正反義片段引物行 RT-PCR 擴增，擴增產物分別與 pMD18-T 質粒連接后轉化E.coliDH5α，獲得的 pMD18-T-SQE-S、pMD18-T-SQE-A 重組質粒經雙酶切后，將正反義片段與質粒 pMHZ112 反向連接，轉化E.coliDH5α，構建SQE基因 RNAi 雙元表達載體 pMHZ112-SQE。電擊法將鑒定正確的重組質粒 pMHZ112-SQE 轉化農桿菌 GV3101 感受態細胞，再利用農桿菌介導法轉化人參愈傷組織，提取抗性人參愈傷組織細胞基因組 DNA，進行 PCR 檢測并計算抗性愈傷轉化率；同時提取人參皂苷，采用 HPLC 方法檢測抗性人參愈傷組織的皂苷含量。

結果結果顯示總 RNA 較完整無降解，質量較好；RT-PCR擴增產物正反義片段大小與預期一致；重組質粒pMD18-T-SQE-S、pMD18-T-SQE-A 和 pMHZ112-SQE 分別經雙酶切進行測序鑒定，結果表明目的基因已插入重組質粒且連接方向正確。人參愈傷組織細胞基因組 DNA 的PCR 檢測結果顯示 1 個菌落經 2 對引物擴增結果均呈陽性，證明構建的 pMHZ112-SQE 重組質粒已成功整合入植物基因組中，其抗性愈傷轉化率為 1%。轉化 pMHZ112-SQE重組質粒后，人參抗性愈傷組織中單體皂苷 Rg1、Re、Rc 含量明顯下降，Rb1 略有升高，實驗組與對照組（轉化空質粒）間 Rg1、Re、Rb1、Rc 的含量差異顯著（均P＜ 0.05）；而 2 組均未檢測出 Rb2 和 Rd。

結論成功構建了SQE基因 RNAi 雙元表達載體，通過轉化人參愈傷組織抑制SQE基因的表達，可以調控人參皂苷含量發生相應的改變。

人參； 基因； 藥物載體； 皂苷類

鯊烯環氧酶（squalene epoxidase，SQE）是一種單加氧酶，它是三萜皂苷生物合成途徑中的關鍵酶之一，其基因所編碼的酶可催化鯊烯（squalene）生成 2,3-氧化鯊烯[1]。SQE 主要作用于單氧態氧化鯊烯生成 2,3-氧化鯊烯，2,3-氧化鯊烯是植物體內甾體、皂苷、倍半萜等許多萜類衍生物質的合成前體，這些物質在植物的生長發育或抗病過程中具有重要作用。據目前研究表明，SQE基因在不同物種中均有表達[2-4]。RNA 干擾（RNAi）主要是通過雙鏈 RNA 的介導，特異性地降解相應序列的靶mRNA，從而阻斷相應基因表達，是一種轉錄后水平的基因沉默方法[5]。為了進一步研究SQE基因在人參皂苷合成途徑中的作用，本研究根據 RNAi原理，以SQE為靶基因，構建SQE基因植物高效 RNAi 雙元表達載體，轉化人參愈傷組織，進而分析轉化前后單體皂苷含量的變化，以期為揭示人參中關鍵酶基因的功能、提高皂苷含量提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 5年生人參葉采自吉林省汪清縣，并利用其誘導獲得人參愈傷組織細胞。

1.1.2 菌株與質粒 大腸桿菌菌株E.coliDH5α和農桿菌 GV3101 均由吉林農業大學細胞工程實驗室保存提供；pMD18-T 質粒購自天根生化科技（北京）有限公司；植物雙元表達質粒 pMHZ112為本實驗室自行構建。

1.1.3 主要試劑與儀器 總 RNA 提取劑（Trizol-A+）購自天根生化科技（北京）有限公司；第一鏈 cDNA 合成試劑盒、T4 DNA 連接酶購自富酶泰斯生物技術（深圳）有限公司；限制性內切酶XbaI、BamHI、XhoI、HindIII 購自寶生物工程（大連）有限公司；其他生化試劑均購自上海生工生物工程技術服務有限公司。梯度 PCR 儀和恒溫金屬浴均購自杭州博日科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計與合成 參考注冊的五加科植物鯊烯環氧酶基因 AB003516、AB122078、FJ393274、EU131089、DQ457054、DQ386734 序列進行比對，找到SQE基因的保守區域位于 1135 ～1469 bp。然后根據其保守區的基因信息，應用引物設計軟件 DNA star 和 NTI9.0 設計人參 SQE 干擾片段的引物，同時根據載體的多克隆位點及應用Primier5.0 對片段進行酶切位點分析后，在正義片段 S 上下游引物中分別引入XbaI、BamHI 酶切位點，反義片段 A 上下游引物中分別引入XhoI、HindIII 酶切位點。其中正義片段 S 上游引物 S1序列為 5’ TGCTCTAGACACTTTTATTAGGGGAT GC 3’，下游引物 S2 序列為 5’ CGCGGATCCAAG AAGTGGAGAAATAGGC 3’；反義片段 A 上游引物 A1 序列為 5’ CCGCTCGAGCACTTTTATTAG GGGATGC 3’，下游引物 A2 序列為 5’ CCCAAGC TTAAGAAGTGGAGAAATAGGC 3’；丙酮酸脫氫酶激酶內含子（PDK Intron）上游引物 P1 序列為5’ AGCGAATTCTAGTATAAAATAGTTAAGTG 3’，下游引物 P2 序列為 5’ ATGGAATTCCAATCCAA ATGTAAGATC 3’。引物均由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.2.2SQE基因 RNAi 雙元表達載體的構建 構建策略見圖 1。利用 Trizol 法提取人參葉總RNA，反轉錄合成 cDNA。以 cDNA 為模板，分別以 S1/S2 和 A1/A2 為引物，通過 RT-PCR 方法克隆SQE基因正義及反義片段，然后在 T4 DNA 連接酶作用下分別與 pMD18-T 質粒連接，轉化E.coliDH5α，獲得SQE基因正反義干擾片段，經雙酶切后測序鑒定正確的質粒分別命名為 pMD18-T-SQE-S 和 pMD18-T-SQE-A。提取pMD18-T-SQE-S 和 pMD18-T-SQE-A 質粒，分別用XbaI、BamHI 和XhoI、HindIII 雙酶切正反義片段及質粒 pMHZ112，回收相應 DNA 片段，用T4 DNA 連接酶將正反義片段與質粒 pMHZ112反向連接，連接后的載體轉化E.coliDH5α，置于5 ml含 15 mg/L 四環素的 LB 培養基中，37 ℃、倒置培養過夜，挑取單菌落進行 PCR 鑒定。將轉化大腸桿菌成功的重組質粒命名為 pMHZ112-SQE，并利用 PDK 引物進行方向性鑒定。

圖 1 SQE基因RNAi雙元表達載體構建示意圖Figure 1 Schematic diagram of RNAi binary expression vector construction of SQE genes

1.2.3 轉化農桿菌侵染人參愈傷組織 利用電擊法將鑒定正確的重組質粒 pMHZ112-SQE 轉化農桿菌 GV3101 感受態細胞，將轉化后細胞置于含有 15 mg/L 四環素的 LB 固體平板中，28 ℃ 倒置培養 2 ～ 3 d 后，挑取單菌落進行 PCR 鑒定。將人參愈傷組織加入裝有農桿菌菌液（A550值為 0.6）的三角瓶中，侵染 8 ～ 10 min 后轉移至含有0.5 mg/L 芐氨基嘌呤（BA）、0.1 mg/L 萘乙酸（NAA）的 MS 培養基中共培養，23 ℃ 暗培養3 d 后，再轉入含有 0.5 mg/L BA、0.1 mg/L NAA、400 mg/L頭孢霉素（Cef）的 MS 抑菌培養基中，23 ℃ 暗培養 7 d，每 2 d 更換 1 次培養基。最后轉至含有 0.5 mg/L BA、0.1 mg/L NAA、20 mg/L 卡那霉素（Kan）的 MS 篩選培養基中，每隔 7 d 更換 1 次培養基，篩選抗性人參愈傷組織細胞。

提取陽性人參愈傷組織細胞基因組 DNA，分別用引物 S1/P2 和 A2/P1 進行 PCR 擴增，并取擴增產物行瓊脂糖凝膠電泳。1 個菌落經 2 對引物擴增結果均呈陽性，則證明構建的 pMHZ112-SQE 重組質粒已成功整合入植物基因組中。同時選擇 3 個批次穩定生長的陽性人參愈傷組織細胞，每個批次分別隨機抽取 20 瓶進行 PCR 驗證后，計算抗性愈傷轉化率。

1.2.4 皂苷含量測定 選擇 PCR 檢測呈陽性的人參愈傷組織，按照參考文獻[6]以索氏提取法提取人參皂苷。實驗分為轉化 pMHZ112-SQE 重組質粒的實驗組和轉化 pMHZ112 空質粒的對照組，采用 HPLC 方法，測定人參皂苷中 6 種主要單體皂苷 Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd 的含量，并比較分析各單體皂苷的含量差異。HPLC 色譜條件：Hypersil-C18 色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；水-乙腈（41∶9）流動相；柱溫 35 ℃，檢測波長203 nm，進樣量 20 μl，流速為 1.3000 ml/min；采用梯度洗脫方式。

1.3 統計學處理

應用 SPSS16.0 統計學軟件進行數據處理，各組單體皂苷含量的比較采用方差分析，以P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 正反義片段 SQE-S 和 SQE-A 的克隆與鑒定

以 5年生人參葉片為材料提取總 RNA，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示 28S rRNA、18S rRNA、5.8S rRNA 特征條帶清晰，表明總 RNA 比較完整無降解，質量較好，符合后續功能基因克隆、表達的要求（圖 2）。

圖 2 人參總 RNA 瓊脂糖凝膠電泳分析Figure 2 Agarose gel electrophoresis analysis of ginseng total RNA

利用提取的總 RNA，經反轉錄合成 cDNA 模板，分別以 S1/S2 和 A1/A2 為引物 PCR 擴增SQE 基因正義片段 S 與反義片段 A，經瓊脂糖凝膠電泳檢測在 364 bp 處均可見單一明顯特異性條帶，與預期的 DNA 表達片段大小一致（圖 3）。

圖 3 SQE 基因正義片段 S 與反義片段 A 的 PCR 擴增Figure 3 The results of sense-S and the antisense-A by PCR amplification

pMD18-T-SQE-S 和 pMD18-T-SQE-A 分別經雙酶切后進行測序鑒定，結果分別可見大小約為364 bp 和 2700 bp 的SQE基因正反義片段和pMD18-T 質粒條帶，證明目的基因已插入重組質粒，測序結果與預期一致（圖 4、5）。

圖 4 pMD18-T-SQE-S 重組質粒的雙酶切鑒定Figure 4 Identification of recombinant plasmid pMD18-TSQE-S by double restriction enzyme digestion

圖 5 pMD18-T-SQE-A 重組質粒的雙酶切鑒定Figure 5 Identification of recombinant plasmid pMD18-TSQE-A by double restriction enzyme digestion

2.2 雙元表達載體 pMHZ112-SQE 的構建

將 pMHZ112-SQE 重組質粒分別用限制性內切酶XbaI 與HindIII、XhoI 與BamHI 雙酶切，經瓊脂糖凝膠電泳后分別可見大小約為 1 kb 和28.1 kb 的 S/A+PDK 和 pMHZ112 質粒條帶，表明SQE基因連接方向正確，pMHZ112-SQE 重組質粒構建成功（圖 6）。

2.3 pMHZ112-SQE 轉化人參愈傷組織的PCR檢測

提取陽性人參愈傷組織細胞基因組 DNA，經PCR 擴增后行瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示 1 個菌落經 2 對引物擴增結果均呈陽性（圖 7）。對 3 個批次陽性人參愈傷組織細胞的檢測結果表明，抗性愈傷轉化率為 1%。

圖 6 pMHZ112-SQE 重組質粒的雙酶切鑒定Figure 6 Identification of recombinant plasmid pMHZ112-SQE by double restriction enzyme digestion

圖 7 pMHZ112-SQE 重組質粒轉化人參愈傷組織的 PCR檢測Figure 7 The PCR detection of ginseng callus transformed by recombinant plasmid pMHZ112-SQE

圖 8 pMHZ112-SQE 重組質粒轉化人參愈傷組織中 6 種單體皂苷的含量Figure 8 The content of 6 saponin monomer in ginseng callus transformed by recombinant plasmid pMHZ112-SQE

2.4 pMHZ112-SQE 轉化人參愈傷組織的皂苷含量

提取陽性人參愈傷組織的人參皂苷，HPLC 法測定 6 種主要單體皂苷 Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd 的含量，結果在轉化空質粒和 pMHZ112-SQE重組質粒的人參愈傷組織中均檢測出 Rg1、Re、Rb1、Rc 這 4 種單體皂苷，并且與陰性對照組相比，實驗組 Rg1、Re、Rc 的含量大幅度下降，而Rb1 的含量則略有增加；但兩組均未檢測出 Rb2和 Rd 這 2 種單體皂苷（圖 8）。由此可見，通過RNAi 干擾抑制SQE基因的表達，可以使人參單體皂苷含量發生相應的改變。

利用 SPSS16.0 統計學軟件對轉化空質粒與轉化 pMHZ112-SQE 重組質粒的人參愈傷組織中皂苷含量進行差異性分析，結果顯示 2 組間單體皂苷 Rg1、Re、Rb1、Rc 含量差異顯著（均P＜0.05），而 Rb2、Rd 在 2 組中含量均為 0，不存在差異（表 1）。

表 1 pMHZ112-SQE 重組質粒轉化人參愈傷組織中皂苷含量的差異性分析Table 1 The difference analysis of saponin monomer content in ginseng callus transformed by recombinant plasmid pMHZ112-SQE

3 討論

人參的次生代謝十分復雜，至今為止雖然不斷有相關報道，但人參皂苷的合成途徑尚不清楚。SQE是皂苷合成途徑過程中最后一個通用酶[7]，在隨后的催化反應中可產生植物激素、植物甾醇或皂苷三萜類化合物，其基因所編碼的酶催化鯊烯生成的2,3-氧化鯊烯，在經過一系列的質子化、環化、重排和去質子化作用后可形成三萜皂苷元[8]。

SQE 是人參皂苷合成途徑中的關鍵酶之一，理論上通過抑制SQE基因的表達，可使人參皂苷的含量有所降低。本研究結果表明，RNA 干擾后人參單體皂苷 Rg1、Re、Rc 含量下降，而 Rb1 的含量則有所升高，其原因可能是 RNA 干擾的不徹底，由于干擾時存在底物的競爭性，從而導致干擾后含量的增加；其次，干擾效果還受轉化材料的限制，轉化的人參愈傷組織比較松散，除菌不夠徹底，可能存在部分假陽性現象；再次，RNA 干擾是一個復雜的過程，是多基因協同作用的結果，人參皂苷合成也是一個復雜的過程，其相關酶與相關酶之間、相關酶與皂苷之間相互聯系、相互作用，只抑制某一單基因的表達，對次生代謝終產物含量不會有顯著影響。

總之，本研究在成功構建SQE基因 RNAi 雙元表達載體的基礎上，通過轉化人參愈傷組織檢測分析表明 RNAi 可使人參單體皂苷含量發生相應的改變，為了解皂苷合成中關鍵酶和皂苷合成的相關機制奠定了理論基礎。

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www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2011, 6(2):121-126

The construction and transformation of GinsengSQEgene interference vector

YU Yan-ting, REN Li, SUN Chun-yu, JIANG Shi-cui, WANG Yi, ZHANG Mei-ping

ObjectiveTo explore the effects ofSQEgene on ginsenoside synthetic.

MethodsAccording to the conservative region sequence ofSQEgene, primers of the sense and antisense fragments were designed and synthetized respectively for RT-PCR, and the amplification products were connected with plasmid pMD18-T, then transformed into theE.coliDH5α.After the obtained recombinant plasmids pMD18-T-SQE-S, pMD18-T-SQE-A were double-enzyme digested,the sense and antisense fragments were subsequently inserted reversely to plasmid pMHZ112, then transformed intoE.coliDH5α to construct the pMHZ112-SQE, which was the RNAi binary expression vector ofSQEgene.The correctly identified recombinant plasmid pMHZ112-SQE was transformed into the GV3101 Agrobacterium competent cells by electrotransformation, then transformed the ginseng callus by Agrobacterium-mediated approach.The genomic DNA of resistant ginseng callus were extracted for PCR, and calculated resistance ginseng callus transformation ratio; Simultaneously, the ginsenosides were extracted to detect the ginsenosides content of resistance ginseng callus by HPLC.

ResultsRT-PCR result showed that the total RNA was intact and had better quality without degradation; the sense and antisense PCR amplification fragments were consistent with the expected sequences.After the recombinant plasmids pMD18-T-SQE-S,pMD18-T-SQE-A and pMHZ112-SQE were identified by double restriction enzyme digestion, the results showed that the target gene was inserted into the recombinant plasmid with correct orientation.The PCR results of ginseng callus genomic DNA showed that the amplification results of one colony with two pairs of primers were all positive, proving that the recombinant plasmid pMHZ112-SQE was integrated into the plant genome successfully, and the transformation ratio of resistant ginseng callus was 1%.After transformation of the recombinant plasmid pMHZ112-SQE, the contents of monomer saponin Rg1、Re、Rc were measurablly reduced,and Rb1 was insignificant increased in resistance ginseng callus.The contents of Rg1、Re、Rb1、Rc between experimental group and control group (transformed by empty plasmid) had significant difference (P＜ 0.05); and neither of them showed detectable monomer saponin Rb2 and Rd.

Conclusion The RNAi binary expression vector ofSQEgene was constructed successfully, and the ginsenosides content could be controlled accordingly by inhibiting the expression ofSQEgene in ginseng callus.

GINSENG; Genes; Drug carriers; SAPONINS

ZHANG Mei-ping, Email: wzhaoyun@tom.com

www.cmbp.net.cn 中國醫藥生物技術, 2011, 6(2):121-126

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2011.02.008

130118 長春，吉林農業大學生命科學學院細胞工程實驗室

張美萍，Email：wzhaoyun@tom.com

2011-01-11

Author Affiliation: Cell Engineering Laboratory of Life Science College, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China

·綜述·