羧胺三唑與小劑量地塞米松合用對A549肺癌移植瘤生長抑制作用的研究

鞠瑞，武丹威，郭磊，李娟，葉菜英，張德昌

·論著·

羧胺三唑與小劑量地塞米松合用對A549肺癌移植瘤生長抑制作用的研究

鞠瑞，武丹威，郭磊，李娟，葉菜英，張德昌

目的觀察羧胺三唑（CAI）對 A549 肺癌移植瘤生長及腫瘤環境中腫瘤壞死因子-α 含量和血管生成的影響，研究小劑量地塞米松（DEX）是否能通過降低腫瘤環境中腫瘤壞死因子-α 含量和抑制血管生成增強 CAI 對移植瘤生長的抑制作用。

疾病模型，動物； 抗腫瘤藥； 地塞米松；腫瘤壞死因子-α； 血管生成抑制劑

非細胞毒抗腫瘤藥物羧胺三唑（carboxyamidotriazole，CAI）具有抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡和抑制血管形成等作用[1-3]。而我們在之前的研究中新發現 CAI 在一系列急慢性炎癥模型中表現出抗炎作用，能夠顯著抑制炎癥介質——腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的釋放[4]。因此在本文中，我們首先提出了 CAI 對腫瘤環境中 TNF-α 也有調控作用的假設。TNF-α 不僅是炎癥反應中十分重要的一種細胞因子，在腫瘤發生階段和侵襲轉移階段也扮演促進腫瘤發展的關鍵角色，是促進血管形成的一種重要的細胞因子，血管內皮生長因子（VEGF）的表達也依賴于 TNF-α 的調控[5]。地塞米松（dexamethasone，DEX）是一種皮質類固醇藥物，具有很強的抗炎作用，能抑制巨噬細胞分泌包括TNF-α 在內的多種炎性細胞因子，在腫瘤的治療中也十分常見[6]。在本項研究中，我們研究了 CAI 與小劑量 DEX 聯合應用（combination，COM）是否能增強 CAI 對移植瘤生長的抑制作用以及是否能進一步降低 TNF-α 在腫瘤環境中的含量；給予TNF-α 特異性拮抗劑——英夫利昔單抗（TNF-α antibody，TAB）研究 TNF-α 在該模型腫瘤生長中的作用；并對腫瘤組織內的血管用 CD31 抗體進行染色以初步解釋藥物作用。目前的 CAI 單獨應用或與化療藥物合用的臨床試驗數據表明，CAI 治療腫瘤的療效并不理想，合并用藥方案也未能有效地使抗腫瘤作用增強[7-9]。優化 CAI 的抗腫瘤作用和發展新的聯合用藥方案具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1細胞系 A549 肺癌細胞購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞中心。

1.1.2實驗動物 40 只 6 ～ 8 周齡裸小鼠，體重18 ～ 20 g，合格證號：0156072，購自中國醫學科學院動物所。在溫度（22 ± 2）℃、濕度 40％ ～ 70％、每日 12 h 光照環境下飼養。

1.1.3試劑 CAI 由中國醫學科學院藥物研究所提供；聚乙二醇 400（PEG 400）購自北京化學試劑公司；DEX 購自天津金耀氨基酸有限公司；RPMI1640 培養基購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞中心；胎牛血清購自美國 Gibco 公司；CD31 抗體（MEC13.3）購自美國 Biolegend 公司；OCT 包埋劑、FITC 標記的山羊抗大鼠 IgG 二抗購自北京中衫金橋生物技術有限公司；TNF-α ELISA 檢測試劑盒購自美國 R＆D 公司。

1.1.4實驗儀器 ThermoForma Series II 水套CO2培養箱購自美國 Thermo 公司；CM1900 型冰凍切片機和 DM5000B 型熒光顯微鏡均購自德國徠卡公司；Synogen 4 酶標儀購自美國基因公司。

1.2 方法

1.2.1體外細胞培養 A549 細胞用 RPMI1640培養基（加入 10％ 胎牛血清、1％ L-谷氨酰胺、50 mg/ml 青霉素和 100 mg/ml 鏈霉素）在 37 ℃、5％ CO2環境中培養。

其中，OD樣本為加入荷葉發酵上清和細胞孔的吸光值，OD空白為不加入荷葉上清液和細胞孔的吸光值，OD對照為只加入細胞孔的吸光值。

1.2.2A549 移植瘤模型 收集處于對數生長期的 A549 細胞，用 PBS 調整細胞密度至 2 × 107個/ml，向每只裸小鼠右側腋窩內注射 0.1 ml，即 2 × 106個/只。接種后將小鼠隨機分為 5 組：溶劑 PEG 400 組、CAI 組、DEX 組、CAI 與 DEX合用（COM）組和英夫利昔單抗（TAB）組，每組8 只小鼠。接種 A549 細胞后第 2 天給藥：PEG 400 組和 CAI 組小鼠每天灌胃給藥一次，0.1 ml/ 10 g 體重，CAI 劑量為 20 mg/kg；DEX 組每周背部皮下注射給藥兩次，劑量為 1 mg/kg；CAI 和DEX 合用組給藥方式和劑量為：CAI 每天灌胃給藥一次，劑量為20 mg/kg，DEX 每周背部皮下注射給藥兩次，劑量為 1 mg/kg；英夫利昔單抗每周腹腔注射給藥兩次，劑量為 10 mg/kg。給藥 40 d后處死小鼠，剝離腫瘤組織并稱重。將一部分腫瘤組織浸入 OCT 包埋劑，在液氮液面上方凍成硬塊，保存于 –80 ℃，以備制成冰凍切片；將一部分腫瘤組織保存于 –80 ℃，以備勻漿。

1.2.3腫瘤組織 CD31 血管染色 將 OCT 包埋的腫瘤組織用冰凍切片機制成 8 μm 冰凍切片，將切片立即置于甲醇中固定 2 min 后浸于 pH 7.4 PBS 中清洗，之后滴加 5％ 牛血清白蛋白（BSA）在 37 ℃ 孵育 40 min。用 pH 7.4 PBS 清洗后滴加大鼠抗小鼠 CD31一抗（1∶200稀釋）孵育，4 ℃ 過夜。第 2 天將切片在室溫平衡 1 h 后，用 pH 7.4 PBS 清洗 5 min 并重復 3 次，然后滴加 FITC 標記的山羊抗大鼠 IgG 二抗，室溫避光孵育 2 h 后，用 pH 7.4 PBS 清洗，5 min × 3。封片后用熒光顯微鏡觀察照相。

1.2.4腫瘤組織內 TNF-α 含量檢測 每組取4 個腫瘤組織，在液氮冷凍條件下用研缽將腫瘤組織研磨成粉末，然后收集于試管中稱重，按 500 μl/g組織的比例向粉末中加入放射免疫沉淀裂解液（radio immuno precipitation assay，RIPA），其中含苯甲基磺酰氟（PMSF）1 mmol/L、二硫蘇糖醇（DTT）1 mmol/L、亮抑酶肽（leupeptin）5 μg/ml、抑蛋白酶肽（aproptinin）5 μg/ml，置冰上使用組織勻漿器勻漿 30 s，將組織懸液在 4 ℃ 以 15 000 × g 超速離心 30 min。取離心上清，用 Bradford 方法對總蛋白進行定量。用 ELISA 試劑盒檢測腫瘤組織蛋白勻漿中 TNF-α 的濃度，用 TNF-α 濃度/總蛋白濃度表示 TNF-α 在腫瘤組織蛋白勻漿中的含量。

1.3 統計學處理

應用 SPSS13.0 統計學軟件進行數據處理，對照組與給藥組檢測結果的比較采用 Student’s t 檢驗，以 P ＜ 0.05 為有統計學意義的差異。

2 結果

2.1 CAI 和（或）DEX 對 A549 移植瘤生長的抑制作用

A549 移植瘤模型建立 40 d 后，處死小鼠并剝離瘤組織，發現藥物合用組的腫瘤組織體積明顯小于溶劑對照 PEG 組（圖 1）。各組瘤重分別為：PEG 組（0.23 ± 0.04）g；CAI 組（0.21 ± 0.02）g；DEX 組（0.17 ± 0.04）g；COM 組（0.12 ± 0.03）g；TAB 組（0.17 ± 0.04）g（圖 2）。CAI 與 DEX 合用使瘤重降低了 49.1％。

圖1 A549 移植瘤模型建立 40 d 后剝離的 PEG 組和COM 組的腫瘤組織，分別取 PEG 組和 COM 組 4 個腫瘤組織進行照相Figure 1 Tumor tissues isolated after 40 days of treatment in the A549 xenograft tumor model，4 tumor tissues in PEG or COM group were taken for photos

圖2 A549 移植瘤模型建立 40 d 后各組瘤重，給藥 40 d后處死小鼠，剝離腫瘤組織并稱重（n = 8）。*，與 PEG 組相比P＜ 0.01Figure 2 Tumor weights after 40 days of treatment in the A549 xenograft tumor model. The tumors were isolated and weighed after 40 days of treatment (n = 8). *，P＜ 0.01，compared with PEG group.

2.2 CAI 和（或）DEX 對 A549 移植瘤組織內血管生成的抑制作用

我們對各組腫瘤組織冰凍切片進行 CD31 熒光染色觀察血管數目的變化，發現 CAI 和 DEX均能減少血管生成，而藥物合用組中的血管數目被降至更低水平（圖 3）。

2.3 CAI 和（或）DEX 降低 A549 移植瘤組織TNF-α的含量

我們對各組腫瘤組織勻漿中 TNF-α 的含量進行了測定。PEG、CAI、DEX、COM 和 TAB 組腫瘤組織勻漿中 TNF-α 的含量分別為（933.9 ± 286.8）、（636.1 ± 157.4）、（684.9 ± 170.1）、（364.7 ± 0.1）和（606.8 ± 190.3）pg/mg 蛋白（圖 4）。結果顯示，CAI 和 DEX 單用均可下調 TNF-α 的含量，兩藥合用使 TNF-α 含量降至更低的水平。

圖3 各組腫瘤組織內血管染色，將腫瘤組織 8 μm 冰凍切片用大鼠抗小鼠 CD31 一抗和FITC 標記的山羊抗大鼠IgG 二抗依次孵育，封片后用熒光顯微鏡觀察照相（10 ×）（A：PEG；B：CAI；C：DEX；D：COM）Figure 3 Immuno-fluorescent staining for CD31 in tumor tissues. The frozen sections (8 μm) were incubated with anti-mouse CD31 primary antibody and followed by FITC-conjugated second antibody. The photos were captured by a fluorescent microscope (10 ×) (A: PEG; B: CAI; C: DEX; D: COM)

圖4 各組腫瘤組織內 TNF-α 的含量。*，與 PEG 組相比P＜ 0.01Figure 4 TNF-α concentration in tumor tissues. *，P＜ 0.01，compared with PEG group.

3 討論

本項研究表明，羧胺三唑（CAI）不僅能夠直接影響腫瘤細胞[抑制增殖、誘導凋亡、抑制腫瘤細胞中血管內皮細胞生長因子（VEGF）的生成等]，還能通過調控腫瘤環境中 TNF-α 控制腫瘤的發展。DEX 具有抗炎作用，對 TNF-α 的合成有較強的抑制作用，與 CAI 合用后使其抗腫瘤作用增強。

CAI 和 DEX 均能在一定程度上抑制 A549移植瘤的生長，合用之后的抗腫瘤作用被顯著增強。我們在該移植瘤生長過程中給予 TNF-α 抗體藥物英夫利昔單抗，發現拮抗TNF-α 能夠使腫瘤生長減緩。一些臨床試驗數據確實表明，英夫利昔單抗能夠穩定晚期癌癥患者的病情，其單獨應用和與化療藥物合用均取得了良好的療效[10-12]。針對促腫瘤發展細胞因子 TNF-α 進行抗腫瘤治療被廣泛認可[13]。

TNF-α 在腫瘤的發生發展過程中作用較廣，目前研究較多的是其促血管生成作用。在腫瘤微環境中，TNF-α 可能能夠使骨髓系祖細胞向內皮細胞分化[14]，VEGF 的變化也依賴于 TNF-α 的調控[5]。我們對 A549 移植瘤組織的冰凍切片進行血管染色后發現，CAI 能抑制血管的生成，這與目前文獻[15]報道的 CAI 的血管抑制作用一致。由于在之前的研究中發現 CAI 在急慢性炎癥中均表現出對TNF-α 釋放的抑制作用，我們提出了 CAI 也能夠調控腫瘤環境中 TNF-α 含量的假設。對腫瘤組織中 CD31 分子染色，觀察各組血管數目的差異，結果顯示 CAI 和 DEX 單用均能減少血管的數目，這與目前對兩種藥物的認識一致：CAI 能夠抑制腫瘤細胞 VEGF 的釋放，而 DEX 也在多種模型上被發現具有抗血管生成作用，如能夠通過抑制 H22肝癌細胞中 VEGF 的表達抑制 H22 移植瘤的生長[16]。我們在本實驗中發現兩者合用組的血管數目降至極低的水平。由于兩種藥物均具有抗炎作用，且 VEGF 的表達受到 TNF-α 的調控，我們對各組腫瘤組織內 TNF-α 的含量進行了檢測。結果顯示，CAI 和 DEX 確實都對腫瘤組織內的 TNF-α 有下調作用，而兩者合用對其抑制作用最為明顯，其含量水平甚至低于英夫利昔單抗給藥組。各組TNF-α 含量的差異與各組瘤重的差異吻合。

總之，本實驗發現了小分子藥物 CAI 與小劑量DEX 合用之后對腫瘤環境中 TNF-α生成和 A549移植瘤生長的強抑制作用，其作用可與 TNF-α 特異性拮抗劑英夫利昔單抗相比，甚至優于后者。在給藥過程中，始終沒有發現糖皮質激素相關的不良反應，此合用方案有著良好的耐受性。本項研究對于優化 CAI 的抗腫瘤作用有著重要的意義，并為肺癌治療提供了一種可能的聯合用藥方案。

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Carboxyamidotriazole and low dose dexamethasone significantly inhibit the growth of A549 xenograft tumors

JU Rui，WU Dan-wei，GUO Lei，LI Juan，YE Cai-ying，ZHANG De-chang

ObjectiveTo investigate the effect of carboxyamidotriazole (CAI) on the A549 xenograft tumor growth as well as the tumor necrosis factor-α (TNF-α) level and angiogenesis in tumor microenvironment; to investigate whether the antitumor effect of CAI could be enhanced by low dose dexamethasone (DEX) via further decreasing the TNF-α level and inhibiting angiogenesis.MethodsA549 xenograft tumor model was established by injecting A549 cells into the subcutaneous tissue of the right axillary fossa of nude mice. The tumor bearing mice were divided into 5 groups and treated with CAI and/or DEX (PEG400 vehicle group: intragastric administration daily by 0.1 ml/10g bodyweight; CAI group: intragastric administration daily by 20 mg/kg; DEX group: subcutaneous administration twice a week for 1 mg/kg; combination group (COM): CAI，intragastric administration daily by 20 mg/kg，DEX，subcutaneous injection twice a week for 1 mg/kg; TNF-α antibody group (TAB): peritoneal injection twice a week for 10 mg/kg) on the next day. After 40 days，the tumors were isolated and weighed. The tissues were immediately frozen for preparation of frozen sections or tissue homogenates. The frozen sections were stained for CD31 immuno-fluorescent test. TNF-α concentration in the tissue homogenates was determined by a specific ELISA kit. The involvement of TNF-α in this xenograft model was confirmed by specific TNF-α antagonist infliximab.ResultsCAI，DEX and infliximab could inhibit the growth of A549 xenograft tumors，and the combination of CAI and DEX was the most effective among the groups. The tumor weights of PEG，CAI，DEX，COM and TAB group were (0.23 ± 0.04)，(0.21 ± 0.02)，(0.17 ± 0.04)，(0.12 ± 0.03) and (0.17 ± 0.04)g，respectively. Both CAI and DEX could decrease the number of blood vessels in tumor tissues，and the number decreased to a lower level in the combination group. CAI could inhibit the TNF-α production in tumor tissues，which could also be enhanced by DEX. TNF-α concentrations in tumor tissues of PEG，CAI，DEX，COM and TAB group were (933.9 ± 286.8)，(636.1 ± 157.4)，(684.9 ± 170.1)，(364.7 ± 50.1) and (606.8 ± 190.3)pg/mg total protein，respectively.ConclusionCAI inhibits tumor growth not only by directly acting on tumor cells，but also by suppressing TNF-α production and angiogenesis in the tumor microenvironment，which may be a new antitumor mechanism of CAI. As those actions of CAI could be augmented by low dose DEX，the combination of CAI and low dose DEX may be further developed and applied clinically.

Disease models，animal; Antineoplastic agents; Dexamethasone; Tumor necrosis factor-alpha; Angiogenesis inhibitors

s:ZHANG De-chang，Email: zhangdechang45@vip.sina.com; YE Cai-ying，Email: caiyingye@126.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2011.02.004

科技部“重大新藥創制”科技重大專項（2009ZX09102-049、2009ZX09303-008）；國家自然科學基金（30873075）；中國醫學科學院院所長基金（2009PY01、2010PY08）

100005 北京，中國醫學科學院基礎醫學研究所藥理學系

張德昌，Email：zhangdechang45@vip.sina.com；葉菜英，Email：caiyingye@126.com

2011-01-14

方法向裸鼠腋下接種 A549 肺癌細胞，建立 A549 肺癌移植瘤模型，接種第 2 天隨機分5 組，并開始給藥，分別是 PEG400 溶劑對照組（每天一次灌胃給藥，0.1 ml/10 g 體重）、CAI 組（每天一次灌胃給藥，20 mg/kg）、DEX 組（每周兩次背部皮下注射給藥，1 mg/kg）、CAI 與 DEX 合用組（CAI，每天一次灌胃給藥，20 mg/kg；DEX，每周兩次背部皮下注射給藥，1 mg/kg）及英夫利昔單抗組（每周兩次腹腔注射給藥，10 mg/kg）。40 d 后剝離瘤組織，拍照并稱重；將部分新鮮腫瘤組織速凍后制作冰凍切片，進行 CD31熒光染色；另一部分新鮮瘤組織制備勻漿后用 ELISA 方法對其 TNF-α 含量進行檢測。

結果CAI、DEX 和 TNF-α 抗體（英夫利昔單抗）對移植瘤生長均有抑制作用，而 CAI與 DEX 的聯合應用抑癌作用最強，PEG、CAI、DEX、COM 和 TAB 組瘤重分別為（0.23 ± 0.04）、（0.21 ± 0.02）、（0.17 ± 0.04）、（0.12 ± 0.03）和（0.17 ± 0.04）g。CD31 血管染色顯示，CAI 和 DEX 均能減少腫瘤組織內的血管數目，兩者合用在極大程度上抑制了血管的生成；CAI 能夠降低腫瘤組織內 TNF-α 含量，與DEX 合用使 TNF-α 含量降至更低水平，PEG、CAI、DEX、COM 和 TAB 組腫瘤組織勻漿中 TNF-α 的含量分別為（933.9 ± 286.8）、（636.1 ± 157.4）、（684.9 ± 170.1）、（364.7 ± 50.1）和（606.8 ± 190.3）pg/mg 蛋白。

結論CAI 不僅能夠直接影響腫瘤細胞的增殖和凋亡，還能通過調控腫瘤環境中的 TNF-α 抑制血管的生成，從而減緩腫瘤的生長，這可能是 CAI 發揮抗腫瘤作用一個新的機制。小劑量 DEX 與 CAI 聯合用藥對移植瘤生長的抑制作用明顯增強，優化了 CAI 的抗腫瘤作用，可能成為一種新的聯合用藥方案。

Author Affiliation:Department of Pharmacology，Institute of Basic Medical Sciences，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100005，China

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol，2011，6(2):101-105