微生物來(lái)源的Aurora-B激酶抑制劑的分離、結(jié)構(gòu)鑒定和抗腫瘤活性研究

牛玉強(qiáng)，姜威，余利巖，王彥昶，李妍，司書(shū)毅

微生物來(lái)源的Aurora-B激酶抑制劑的分離、結(jié)構(gòu)鑒定和抗腫瘤活性研究

牛玉強(qiáng)，姜威，余利巖，王彥昶，李妍，司書(shū)毅

目的從微生物代謝產(chǎn)物中分離和純化 Aurora-B 激酶抑制劑并檢測(cè)其抗腫瘤活性。

方法以野生型酵母菌 Y300 和ipl1-321 溫度敏感型突變株為模式菌跟蹤活性組分；從陽(yáng)性放線菌 I07A-01038 發(fā)酵產(chǎn)物中分離純化活性化合物并進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定；體外酶學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證陽(yáng)性化合物對(duì) Aurora-B 激酶的抑制活性；MTT 法檢測(cè)陽(yáng)性化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制活性；AnnexinVFITC/PI 雙染法檢測(cè)活性化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞早期凋亡的誘導(dǎo)作用。

結(jié)果從陽(yáng)性放線菌 I07A-01038 發(fā)酵產(chǎn)物中得到活性化合物酒渣堿甲酯（flazin methyl ester），酒渣堿甲酯對(duì)ipl1-321 突變株具有特異性抑制作用，其在野生型酵母菌株 Y300 和突變株ipl1-321 的 IC50分別為 48 μmol/L 和24 μmol/L；體外酶學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)其對(duì) Aurora-B 激酶具有抑制作用，其 IC50為 10 μmol/L（ATP = 50 μmol/L）；酒渣堿甲酯對(duì) HepG2、A549、Hela 腫瘤細(xì)胞均具有殺傷活性，IC50分別為 13、11 和 10 μmol/L。并能夠誘導(dǎo) Hela 細(xì)胞發(fā)生早期凋亡。

結(jié)論得到一個(gè)微生物來(lái)源的具有抗腫瘤活性的 Aurora-B激酶抑制劑—酒渣堿甲酯。

磷酸轉(zhuǎn)移酶類； 細(xì)胞抑制劑； 細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

激光激酶（aurora 激酶）家族的成員在細(xì)胞有絲分裂的過(guò)程中，參與中心體成熟、染色體固縮、核膜破裂、中心體分離、雙極紡錘體組裝、染色體分離及胞質(zhì)分裂等多個(gè)過(guò)程，通過(guò)將其底物磷酸化來(lái)調(diào)節(jié)中心體、紡錘體、染色體或者細(xì)胞骨架的變化[1]。最近幾年，多項(xiàng)研究表明，在人的多種腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)Aurora激酶家族成員的過(guò)表達(dá)，可通過(guò)干擾其活性從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[2]。作為容易被抑制的激酶，Aurora 家族成員被認(rèn)為是極有希望的腫瘤化療的藥物靶標(biāo)。

本室用酵母突變株ipl1-321 對(duì)樣品庫(kù)進(jìn)行Aurora-B 激酶抑制劑的篩選，得到多個(gè)具有Aurora-B 激酶抑制活性的陽(yáng)性化合物[3]。本研究就是從前期篩選到的陽(yáng)性菌株發(fā)酵液中提取活性成分并研究其抗腫瘤活性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與培養(yǎng)基 乙酸乙酯、甲醇、丙酮，均為分析純，購(gòu)自北京化工廠；F-12、MEM、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)自賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司；HTScan(R) Aurora B Kinase Assay Kit（#7513）試劑盒購(gòu)自美國(guó) CST 公司；AnnexinVFITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自凱基生物公司。1.1.2 菌種與細(xì)胞株 放線菌株 I07A-01038 由本所菌種保藏中心提供；酵母菌株 Y300（Mata ura3-1his3-11，15lue2-3，112trp1-1ade2-1can1-100）由美國(guó)佛羅里達(dá)州立大學(xué) Elledge 實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；ipl1-321（Mata ipl1-321DAM1-HA-his5+）由本實(shí)驗(yàn)室保存；A549 人肺腺癌細(xì)胞株為本實(shí)驗(yàn)室保存，于 F-12 培養(yǎng)基中培養(yǎng)；HepG2 人肝胚細(xì)胞瘤細(xì)胞株為本實(shí)驗(yàn)室保存，于 MEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)；Hela人宮頸癌細(xì)胞株為本實(shí)驗(yàn)室保存，于 DMEN 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.1.3 主要儀器 酶標(biāo)儀為美國(guó) PerkinElmer 公司的 EnVision；流式細(xì)胞儀為美國(guó) BD 公司的FACSCalibur；HPLC 為日本 Shimadzu 公司的Shimadzu LC-10A vp 泵和 SPD-M10Avp 檢測(cè)器；核磁共振儀為美國(guó) Varian 公司的 INOVA-501型；質(zhì)譜儀為英國(guó) Micromass 公司的 Autospec-Ultima-Tof。

1.2 方法

1.2.1 活性化合物的提取、分離、純化 將 30 L放線菌 I07A-01038 的發(fā)酵液離心，收集菌絲體，丙酮浸泡過(guò)夜。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除丙酮后，放在通風(fēng)櫥吹風(fēng)過(guò)夜。用等體積的乙酸乙酯萃取 3 次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙酸乙酯，粗品用少量的甲醇溶解，過(guò)Φ30 mm × 400 mm 的 ODS 柱。用 50%、60%、70%、80%、90%、100% 的甲醇梯度洗脫，分部收集。用酵母菌株ipl1-321 突變株和 Y300 檢測(cè)活性部分，把有活性的 70% 甲醇的第四個(gè)洗脫體積旋轉(zhuǎn)蒸干，經(jīng) HPLC 鑒定為單組分，純度達(dá) 95%以上。

1.2.2 活性化合物對(duì) Aurora-B 激酶的抑制作用 根據(jù) HTScan(R) Aurora B Kinase Assay Kit 試劑盒說(shuō)明建立體外測(cè)活方法：于普通 96 孔板中將100 ng 純化的重組人 Aurora-B 激酶與不同濃度的活性化合物室溫孵育 15 min；設(shè)立空白對(duì)照（不加活性化合物）和本底（不加一抗和活性化合物）；于每個(gè)反應(yīng)體系中加入生物素標(biāo)記的底物多肽和預(yù)冷的腺嘌呤核苷三磷酸（ATP），使底物多肽和 ATP的終濃度分別為 1.5 μmol/L 和 50 μmol/L，室溫孵育 30 min；每孔中加入 50 μl 終止液（50 mmol/L二乙胺四乙酸，pH = 8）終止反應(yīng)。把 25 μl 上述反應(yīng)體系加到含有 75 μl 去離子水的鏈霉親和素包被的 96 孔板中（每孔設(shè)立 3 個(gè)復(fù)孔）；室溫孵育 60 min，洗板 3 次；然后按順序加入一抗，洗板 3 次；加入二抗，洗板 3 次；加入 TMB 底物15 min 后，每孔加入 100 μl 的終止液（2 mol/L H2SO4），450 nm 處檢測(cè)各孔的吸光度。活性化合物對(duì) Aurora-B 激酶抑制率按下列公式計(jì)算：

抑制率% =（1 － A/B）× 100%A：各實(shí)驗(yàn)組吸光度均值 － 本底吸光度均值B：空白對(duì)照組吸光度均值 － 本底吸光度均值1.2.3 MTT 法檢測(cè)活性化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期腫瘤細(xì)胞，消化、計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至 1 × 105個(gè)/ml，加入 96 孔板中，每孔 100 μl，于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。設(shè)立空白對(duì)照。實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的活性化合物溶液，對(duì)照組加入等體積的含 0.05% 二甲基亞砜（DMSO） 的細(xì)胞完全培養(yǎng)液，每組均設(shè) 4 個(gè)復(fù)孔，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 72 h 后，小心吸出孔內(nèi)液體，然后每孔加入由細(xì)胞培養(yǎng)液配制的終濃度為1 mg/ml 的 MTT 100 μl，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h 后，小心吸出孔內(nèi)液體，加 150 μl DMSO，充分振蕩 10 min，溶解結(jié)晶物，于酶標(biāo)儀 490 nm 處測(cè)吸光度值，計(jì)算各組 4 個(gè)復(fù)孔的平均值，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次，以細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率及藥物濃度作曲線，計(jì)算 IC50。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率 =[（對(duì)照組吸光度平均值 － 實(shí)驗(yàn)組吸光度平均值）/對(duì)照組吸光度平均值]× 100%。

1.2.4 AnnexinV-FITC/PI 雙染法檢測(cè)早期細(xì)胞凋亡 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞以1 × 105個(gè)/ml的濃度接種于 6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后，加入終濃度為 0、10、20 mg/ml 的活性化合物細(xì)胞培養(yǎng)液，并設(shè)置空白對(duì)照組。加藥 30 h 后用 0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，細(xì)胞懸液移入潔凈試管中，于 4 ℃ 條件下 100 ×g離心 5 min 沉淀細(xì)胞，棄上清液后用冷 PBS 緩沖液洗 2 次。將收集的細(xì)胞重懸于 100 μl 結(jié)合緩沖液中，分別加入 5 μl AnnexiV-FITC 和 5 μl PI 溶液，輕輕混勻后室溫避光反應(yīng) 15 min，反應(yīng)結(jié)束后再加入 400 μl 結(jié)合緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 活性化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

經(jīng)過(guò)對(duì)放線菌 I07A-01038 的發(fā)酵，30 L 發(fā)酵液經(jīng)分離、純化，得到活性化合物純品 20 mg，純度在 95% 以上。該化合物純品為淡黃色粉末，易溶于甲醇、丙酮、三氯甲烷、乙酸乙酯等常見(jiàn)的有機(jī)溶劑。由 FAB-MS 的測(cè)定顯示該化合物的分子式為 C18H14N2O4，分子量為 322.31。對(duì)該化合物進(jìn)行了1H-NMR 和13C-NMR 的測(cè)定，數(shù)據(jù)見(jiàn)表 1。

表 1 酒渣堿甲酯的 1H-NMRa、13C-NMRb、1H-1H COSYa 和 HMBC數(shù)據(jù)Table 1 1H-NMRa、13C-NMRb、1H-1H COSYa and HMBC of flazin methyl ester

由理化性質(zhì)、分子量、1H-NMR 及13C-NMR核磁譜的測(cè)定數(shù)據(jù)，并結(jié)合文獻(xiàn)[4-7]，確定該化合物的結(jié)構(gòu)為酒渣堿甲酯（flazin methyl ester），為β-咔啉堿類衍生物（圖 1）。

圖 1 酒渣堿甲酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)Figure 1 Structure of flazin methyl ester

2.2 酒渣堿甲酯在酵母細(xì)胞上的 MIC 的確定

酒渣堿甲酯在 24 μmol/L 即能抑制ipl1-321溫度敏感型突變株的生長(zhǎng)，而抑制 Y300 的 MIC為 48 μmol/L。

2.3 酒渣堿甲酯對(duì) Aurora-B 激酶的抑制作用

以抑制率為縱坐標(biāo)，log[μmol/L]為橫坐標(biāo)，繪制濃度－效應(yīng)曲線，并以 OrigenPro 7.5 軟件擬合（圖 2）。顯示隨著酒渣堿甲酯濃度的升高Aurora-B 激酶活性逐漸降低，并呈劑量依賴性，其IC50為 10 μmol/L（ATP = 50 μmol/L 時(shí)）。

圖 2 不同濃度酒渣堿甲酯對(duì) Aurora-B 激酶的抑制作用Figure 2 The effect of flazin methyl ester on the kinase activity of Aurora-B

2.4 MTT 法檢測(cè)酒渣堿甲酯對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用

酒渣堿甲酯能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖，并呈劑量依賴性（圖 3）。酒渣堿甲酯在腫瘤細(xì)胞HepG2、A549、 Hela 上的 IC50分別為 13、11 和10 μmol/L。

2.5 AnnexinV-FITC/PI 雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上（圖 4），左下象限顯示活細(xì)胞，為（FITC-/PI-）；右下象限為早期凋亡細(xì)胞，顯現(xiàn)（FITC+/PI-）；而左上象限為壞死細(xì)胞（FITC-/PI+）。右上象限顯示晚期凋亡細(xì)胞，

圖 3 MTT 法測(cè)定不同濃度的酒渣堿甲酯對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用的量效曲線圖（A：HepG2；B：A549；C：Hela）Figure 3 Dose-effect curve of tumor cell proliferation effect in different concentration by flazin methyl ester (A: HepG2; B:A549; C: Hela)

圖 4 Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測(cè) Hela 細(xì)胞凋亡Figure 4 Quantification of Hela sapoptosis by Annexin-FITC/PI analyses

不同時(shí)期細(xì)胞的百分比

Table 2 The percent of cells after 30 h treatment with different concentrations of flazin methyl ester為（FITC+/PI+）。酒渣堿甲酯處理 Hela 細(xì)胞 30 h后，處于不同時(shí)期的細(xì)胞百分比見(jiàn)表 2。結(jié)果顯示，酒渣堿甲酯可以誘導(dǎo) Hela 細(xì)胞發(fā)生早期凋亡。

表 2 酒渣堿甲酯處理 Hela 細(xì)胞 30 h 后

3 討論

有絲分裂是一個(gè)比較復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，生物體本身具有一整套監(jiān)測(cè)機(jī)制，以確保遺傳物質(zhì)能準(zhǔn)確地分配到子細(xì)胞中，Aurora 激酶在這個(gè)過(guò)程中起著重要作用。同時(shí)，Aurora 激酶的活性和定位以及其功能的正常執(zhí)行也受到其上游調(diào)控分子和伙伴分子的調(diào)控。酵母基因組只編碼一個(gè)激光激酶 IPL1，而哺乳動(dòng)物中有三個(gè)成員：Aurora-A、Aurora-B 和Aurora-C[8-11]。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種包括 ZM447439、VX-680、Hesperadin 在內(nèi)的小分子 Aurora 激酶抑制劑，并已經(jīng)進(jìn)入臨床研究階段[12-15]。

Ipl1-321 溫度敏感型突變酵母菌株在 25 ℃時(shí)生長(zhǎng)良好，但在 37 ℃ 時(shí)不能生長(zhǎng)，即使在 25 ℃條件下，其 IPL1 激酶活性也受到部分損傷[16]，故該菌株比野生型對(duì)激光激酶抑制劑更敏感。本實(shí)驗(yàn)室曾以其為模型篩選了化合物庫(kù)，得到具有Aurora-B 激酶抑制活性的化合物 Jadomycin B 及其兩個(gè)衍生物，證實(shí)了該模型能夠用于 Aurora-B激酶抑制劑的高通量篩選。本研究從前期篩選得到的陽(yáng)性菌株代謝產(chǎn)物中分離到具有 Aurora-B 激酶抑制活性的化合物酒渣堿甲酯，說(shuō)明該模型也可以用于從微生物代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)新的 Aurora-B 激酶抑制劑。

酒渣堿甲酯屬于 β-咔啉堿類化合物，Shiomi等[17]曾于 2005年從鏈霉菌中分離得到，但是其抗腫瘤活性尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。此外，β-咔啉堿類是多靶點(diǎn)的抗腫瘤物質(zhì)[18-19]，不同結(jié)構(gòu)的 β-咔啉堿化合物抗腫瘤活性有很大差異[20]，目前該類化合物的研究方向主要是通過(guò)結(jié)構(gòu)改造，以尋找更好的抗腫瘤衍生物[21-23]。本研究首次發(fā)現(xiàn)其具有 Aurora-B 激酶的抑制活性和抗腫瘤活性，可能對(duì)該類化合物抗腫瘤機(jī)制的深入研究以及結(jié)構(gòu)改造具有比較重要的意義。

在對(duì) I07A-01038 活性組分分離純化過(guò)程中我們還發(fā)現(xiàn)了其他在酵母模型上有抑制活性的成分，進(jìn)一步純化有可能找到其他 Aurora-B 激酶抑制劑。

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www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2011, 6(2):116-120

Isolation, structure identification and anti-tumor activity of potential small-molecular inhibitor of human Aurora-B kinase from microbial nature products

NIU Yu-qiang, JIANG Wei, YU Li-yan, WANG Yan-chang, LI Yan, SI Shu-yi

ObjectiveTo find potential small-molecular Aurora-B kinase inhibitors from microbial metabolites and research on anti-cancer activity.

MethodsIn vitrobiochemical assay was performed to test the inhibition of candidates determined by screening with wild-type yeast strain andipl1-321 temperature sensitive strain.MTT assay was used to evaluate the inhibitory effect of flazin methyl ester on the proliferation of tumor cells.Annexin V-FITC and PI were performed to determine the induction of flazin methyl ester on the early apoptosis of tumor cells.

ResultsThe compound 70-4 named flazin methyl ester was isolated and purified from the fermentation products of a positive strain I07A-01038.The flazin methyl ester inhibited the growth ofipl1-321 temperature sensitive mutant more dramatically than the wild-type yeast cells, and its MIC was 24 μmol/L and 48 μmol/L.The flazin methyl ester inhibited Aurora-B kinase activityin vitro,and its IC50was 10 μmol/L when the ATP concentration was 50 μmol/L.The flazin methyl ester inhibited the growth of tumor cells,such as HepG2, A549 and Hela , and its IC50was 13, 11 and 10 μmol/L respectively.The flazin methyl ester could induce early apoptosis of tumor cells, Hela.

Conclusion A potential small-molecular inhibitor of human Aurora-B kinase, flazin methyl ester, was obtained.

Phosphotransferases; Cytostatic agents; Cell proliferation; Apoptosis

s: LI Yan, Email: jnllyy@yahoo.com.cn; SI Shu-yi, Email: sisyimb@hotmail.com

www.cmbp.net.cn 中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù), 2011, 6(2):116-120

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2011.02.007

100050 北京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所

李妍，Email：jnllyy@yahoo.com.cn；司書(shū)毅，Email：sisyimb@hotmail.com

2011-02-28

Author Affiliations: Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100050, China

·論著·