不同來源成體干細胞BMP-2基因轉染并微囊化后細胞活性及分泌量觀察

沈陽，張書紅，湯亭亭

不同來源成體干細胞BMP-2基因轉染并微囊化后細胞活性及分泌量觀察

沈陽，張書紅，湯亭亭

目的比較不同來源成體干細胞 BMP-2 基因轉染并微囊化后的存活情況，并檢測分泌至微囊外的 BMP-2 蛋白數量。

方法從大鼠的骨髓、脂肪和滑膜組織內分離培養不同類型的成體干細胞：骨髓間充質干細胞（BMSCs）、脂肪干細胞（ADSCs）和滑膜干細胞（SMSCs）。利用高壓靜電裝置制備海藻酸鈉－聚賴氨酸－海藻酸鈉（APA）微囊，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（GFP）標記細胞在微囊內的存活情況。利用含有 BMP-2 基因的重組腺病毒感染不同來源的成體干細胞后微囊化包裹，用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測分泌到微囊外的 BMP-2 蛋白量。

結果包裹 4 周后熒光顯微鏡觀察發現，BMSCs、ADSCs和 SMSCs 可在微囊內長期存活。ELISA 檢測發現，3 種轉基因細胞在微囊化后都可以持續分泌 BMP-2 蛋白，其中BMSCs 分泌最多，在第 2、3、4 周和其他 2 種細胞相比有明顯差異（P＜ 0.01）。

結論3 種來源的成體干細胞都可以作為 BMP-2 基因給藥促進骨再生研究的候選細胞，其中以骨髓來源的間充質干細胞為首選。

成體干細胞； 骨形態發生蛋白質類； 基因轉移技術

大段骨缺損、骨延遲愈合和不愈合是目前骨科臨床治療的難點。通過移植攜帶生物活性分子基因的細胞來促進組織愈合的組織工程方法為解決這一難題提供了新的治療前景。由于自體細胞的應用存在培養時間長、不能應用于急診患者等缺點，非自體細胞的移植受到了廣泛重視。在既往的研究中，我們已確立了一種利用海藻酸鈉-聚賴氨酸-海藻酸鈉（APA）微囊包裹基因轉染成體干細胞的方法，證實微囊可對非自體細胞起到免疫隔離作用，目的蛋白也可持續釋放到微囊外產生生物學效應[1-2]。

在前述研究中我們應用的是骨髓來源的間充質干細胞（BMSCs）作為基因轉染的靶細胞，而在目前的組織工程研究中，脂肪來源的干細胞（ADSCs）和滑膜來源的干細胞（SMSCs）也得到了廣泛應用[3-4]。因此本研究試圖比較骨髓、脂肪、滑膜三種不同來源的干細胞（BMSCs、ADSCs 和SMSCs）在微囊化包裹后的存活情況，以及 BMP-2基因轉染后這些細胞分泌到微囊外的目的蛋白數量，以期為骨再生的微囊化基因給藥研究提供一種最適宜的細胞。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF 級 SD 大鼠，雄性，8 周齡，由上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院實驗動物中心購置。動物生產和使用許可證號碼分別為SCXK（滬）2007-0005 和 SYXK（滬）2007-0007。

1.1.2 試劑和儀器 αMEM 及 DMEM 培養基購自美國 Gibco 公司；胎牛血清（FBS）購自美國 Hyclone 公司；1% 雙抗（100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 鏈霉素）購自美國 Hyclone 公司。海藻酸鈉（批號 032K01911，黏度 0.25 Pa.s）和聚賴氨酸（批號 033K5118）購自美國 Sigma 公司。BMP-2 ELISA 試劑盒（批號 271868）購自美國 R&D 公司；含有 GFP 標記基因的重組腺病毒 Adv-GFP購自美國 Invitrogen 公司；含有 BMP-2 基因的重組腺病毒 Adv-BMP2 由上海生化制品所樓覺人教授提供。

1.2 方法

圖 1 不同來源成體干細胞的形態（倒置顯微鏡 × 40）Figure 1 The morphology of different tissue derived adult stem cells with the appearance of colony forming unit (inverted microscope × 40)

1.2.1 SD 大鼠 BMSCs、ADSCs 和 SMSCs 的分離與培養 采用參考文獻[5]的方法，取大鼠股骨骨髓，稀釋于 10 ml 含 100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 鏈霉素、10% 胎牛血清的 αMEM 培養液中，通過貼壁培養法分離培養 BMSCs。ADSCs的分離培養根據文獻[6]的方法，切取大鼠雙側腹股溝皮下脂肪墊，加入 0.1% I 型膠原酶消化 1 h獲取細胞，接種于含 10% 胎牛血清的 αMEM 培養液中培養。SMSCs 的分離與培養參照文獻[7]的方法，切取大鼠膝關節內滑膜加入 0.25% 胰酶消化 5 min，II 型膠原酶消化 3 min 獲取細胞，接種于含 10% 胎牛血清的 αMEM 培養液中培養。

1.2.2 包裹細胞的微囊制備 在電壓 3 kV、液面距 25 mm、推進速度 30 mm/h 的高壓靜電場成囊裝置中，將含有 3 × 106/ml個細胞的細胞懸液與1.75% 的海藻酸鈉溶液組成的混合液滴入 0.1 mol/L氯化鈣溶液中形成海藻酸鈣微粒，再與 0.05% 聚賴氨酸溶液反應 6 min 使微粒外包裹一層聚賴氨酸，加入 0.15% 海藻酸鈉溶液中和微粒表面電荷，最后用 55 mmol/L 檸檬酸鈉溶液置換出微粒核心中的鈣離子得到微囊。所得微囊置無菌培養皿中，加入 DMEM 培養液 10 ml，37 ℃、5% CO2中培養待用。

1.2.3 Adv-GFP 基因轉染和微囊內細胞活力觀察 分別取 3 種細胞的第 2 代感染 Adv-GFP，每皿細胞生長到全皿的 90% 后，加 1 ml Adv-GFP過夜（MOI = 150），再采用 1.2.2 的方法進行微囊包裹，于 37 ℃、5% CO2培養箱中培養。微囊化 1 ～4 周后分別在熒光顯微鏡下觀察，通過綠色熒光判斷細胞的存活情況。

1.2.4 BMP-2 基因轉染和微囊外基因產物測定 同樣取 3 種細胞的第 2 代感染 Adv-BMP2，每皿細胞生長到全皿的 90% 后，加 2 ml Adv-BMP2過夜（MOI = 100）。取 3 × 106個感染細胞微囊化后置于 15 ml 的培養皿中，于 37 ℃、5% CO2培養箱中培養。包裹后第 1 ～ 4 周每 2 天收集微囊外的上清液保存，分別匯合收集每周累計上清液，利用 BMP-2 ELISA 試劑盒并參照說明書的實驗步驟進行檢測。BMP-2 蛋白的分泌量通過標準曲線計算得出。

1.3 統計學處理

應用 SAS612 統計學軟件進行數據處理。組間細胞 BMP-2 蛋白的分泌量應用單因素方差分析進行統計，以P＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同來源成體干細胞的形態

圖 1 顯示，三種細胞都可以形成集落單位，其中 BMSCs 呈長梭形，而 ADSCs 和 SMSCs 呈短梭形。

2.2 微囊形態和干細胞在微囊內的存活情況

圖 2 顯示，我們制作的包裹或不包裹細胞的微囊的形態大小基本一致。圖 3 是 GFP 標記的BMSCs 在熒光顯微鏡下的照片，包裹干細胞的微囊大小基本一致，表面光滑，直徑大約在 200 μm左右。包裹后 1 周和 4 周時觀察發現，3 種微囊化 GFP 標記細胞在熒光顯微鏡下均可見綠色熒光，證實細胞仍然存活。ADSCs 和 SMSCs 微囊化后形態和微囊內細胞的存活與 BMSCs 一致。

2.3 微囊化干細胞 BMP-2 蛋白分泌量的比較

圖 2 海藻酸鈉-聚賴氨酸-海藻酸鈉微囊的形態（倒置顯微鏡 × 100）Figure 2 The morphology of alginate-poly-L-lysine-alginate microcapsules (inverted microscope × 100)

圖 3 GFP 標記的 BMSCs 在微囊內的存活情況（倒置熒光顯微鏡 × 400），包裹后 1 周（A）和 4 周（B）可見微囊內有綠色熒光標記細胞Figure 3 The viability of GFP labeled BMSCs in the microsapsule at 1 week (A) or 4 weeks(B) after encapsulation indicated by the green fluorence in the micrograph (inverted fluorescence microscope × 400)

圖4 未轉染 BMP-2 基因的 3 種成體干細胞，微囊化后BMP-2 蛋白的基礎分泌量Figure 4 The basic BMP-2 secretion from the microencapsulated cells without BMP-2 gene transfer

圖5 微囊化基因轉染細胞的 BMP-2 蛋白分泌（P ＜ 0.01）Figure 5 All encapsulated BMP-2 gene-transfected stem cells were capable of constitutive secrete BMP-2 proteins (P ＜ 0.01)

3 討論

本研究采用的微囊化技術是將細胞包封在高分子材料形成的選擇性透過膜中，這種透過膜可使小分子的營養物質、囊內活性物質及代謝產物自由出入，防止大分子的免疫球蛋白和免疫細胞的通過，起到免疫隔離作用。微囊內的材料還可延緩生物活性物質的釋放，有利于其在較長時間內發揮作用。1980年，加拿大多倫多大學的 Lim 和 Sun[8]發明了海藻酸-聚賴氨酸-海藻酸（APA）微膠囊，并把豬的胰島細胞微囊化，移植入糖尿病大鼠體內，結果表明該人工細胞成功地調節了血糖水平。后來人們又開始將微囊化技術和基因治療結合，形成微囊化基因給藥技術，即利用重組細胞的代謝產物調節機體生理功能，治療相關疾病，其中大多數研究集中在神經退行性疾病的治療上[9]。

隨著干細胞和再生醫學研究的發展，人們開始利用微囊來包裹胚胎干細胞，研究微環境對干細胞分化的影響[10]。在前期研究中，我們嘗試用微囊來包裹成體干細胞[1-2,11]，證實微囊可對非自體骨髓來源的 BMSCs 細胞起到免疫隔離作用，BMP-2 蛋白也可持續釋放到微囊外產生生物學效應。本研究則進一步證實，APA 微囊也可用于包裹脂肪來源和滑膜來源的干細胞 ADSCs 和 SMSCs，并作為BMP-2 基因給藥研究的候選細胞。同時我們也發現微囊化細胞分泌的 BMP-2 蛋白量隨著時間延長逐漸減少，這可能與細胞在微囊內的存活量逐漸減少有關，也可能與腺病毒的表達周期有關。雖然我們制備的微囊能使細胞在囊內長期存活，但是由于微囊制備材料的生物相容性有待提高、微囊機械強度的不足、微囊壁滲透性不良以及機體免疫細胞對微囊內細胞的殺傷作用等，體內移植仍然面臨微囊內細胞存活時間短、炎性細胞浸潤和纖維化包裹的難題[12]。微囊制備材料的選擇以及微囊制備技術的改進還有很大的空間。

目前已有很多文獻比較肌肉骨骼系統不同來源干細胞在增殖和多向分化能力方面的差異。Hayashi等[13]比較了大鼠骨髓、骨膜、脂肪來源的干細胞的成骨潛能，發現骨髓和骨膜來源細胞的成骨能力優于脂肪來源細胞，而體內異位成骨研究提示骨髓 MSCs 可形成最多的骨組織。Yoshimura等[14]從大鼠骨髓、骨膜、脂肪和肌肉等組織分離培養間充質干細胞，結果發現骨膜和肌肉來源的細胞成骨能力最強。這些結果提示不同來源的干細胞在成骨潛能上有一定的差異。我們的研究結果提示，BMSCs 在轉基因后產生 BMP-2 蛋白的效率最高，由此我們認為 BMSCs 可以作為今后微囊化基因給藥平臺促進骨再生研究的首選細胞。

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www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2011, 6(2):96-100

Observation of viability and BMP-2 secretion of three different microcapsulated adult stem cells transfected with BMP-2 gene

SHEN Yang, ZHANG Shu-hong, TANG Ting-ting

ObjectiveTo test the viability and BMP-2 secretion from microcapsulated BMP-2 gene transfected adult stem cells derived from different tissue.

MethodsThe bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs), adipose-derived stem cells (ADSCs), synovium-derived mesenchymal stem cells (SMSCs) from rat tissue were isolated and encapsulated by the alginate-poly-L-lysine-alginate (APA)microcapsules produced by high voltage electrostatic generator.The viability of GFP labeled cells in APA microcapsules were observed by fluorescence microscope at 1 and 4 weeks after encapsulation.Then the BMSCs, ADSCs and SMSCs were infected by the adenovirus containing BMP-2 gene and encapsulated in APA microcapsules.The ELISA method was used to determine the BMP-2 secretion in supernatant of cultured microcapsules.

ResultsThe viability of encapsulated GFP labeled stem cell could be demonstrated by the microscope at 1 and 4 weeks after encapsulation.All encapsulated BMP-2 gene-transfected stem cells were capable of constitutive secrete BMP-2 proteins.BMSCs could secret most BMP-2 proteins which was significant higher than ADSCs or SMSCs at 2, 3 and 4 weeks (P＜ 0.01) after BMP-2 gene transfection and cells encapsulation.

Conclusion All three kinds of adult stem cells could be used to promote the bone regeneration by the strategy of microcapsule based BMP-2 gene medicine, among which BMSCs is the first choice.

Adult stem cells; Bone morphogenetic proteins; Gene transfer techniques

TANG Ting-ting, Email: tingtingtang@hotmai.com

www.cmbp.net.cn 中國醫藥生物技術, 2011, 6(2):96-100

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2011.02.003

國家自然科學基金（30772183）；上海教委重點學科建設基金（J50206）

200011 上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院骨科/上海市骨科內植物重點實驗室

湯亭亭，Email：tingtingtang@hotmail.com

2011-01-18

Author Affiliations: Shanghai Key Laboratory of Orthopaedic Implant, Department of Orthopaedic Surgery, Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University, School of Medicine, Shanghai 200011, China

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