腸道病毒71型結構蛋白VP1的原核表達及初步鑒定

岳盈盈，李志會，李 鵬，宋楠楠，趙元昊，孟 紅

(山東省醫學科學院基礎醫學研究所，山東省罕少見病重點實驗室，濟南250062)

手足口病(HFMD)是全球性傳染病。引起HFMD的腸道病毒有20多種(型)，以腸道病毒71型(EV71)和柯薩奇病毒A16最為常見;其中EV71引起的HFMD最為嚴重，可引起心肌炎、肺水腫、腦膜腦炎、脊髓灰質炎樣癱瘓等并發癥［1］，病死率高。目前臨床對EV71感染以對癥治療為主，尚無有效的抗病毒藥物。研制安全有效的疫苗和早期診斷試劑盒是防控EV71感染的當務之急。2010年2月，我們采用大腸桿菌表達系統對EV71 VP1蛋白的第2-274aa進行表達及鑒定，并對其表達條件進行優化，旨在為EV71疫苗的研究和檢測試劑盒的建立奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 RD細胞由山東省疾控中心贈送;EV71病毒株、E.coli TOP10、PET30a(+)為本室保存; Transetta(DE3)購自北京全式金生物技術有限公司;pMD18-T載體、限制性內切酶及蛋白酶購自大連寶生物工程公司;1640培養基購自GIBCO公司; D2000 DNA marker、Taq酶、RNA提取試劑盒、質粒純化試劑盒及DNA凝膠電泳回收試劑盒購自北京泰天河生物技術有限公司;其他試劑均為進口或國產分析純。

1.2 目的基因選擇及引物設計 查閱Genbank中VP1基因序列設計引物，在上游引物5'端引入NdeⅠ酶切位點(CATATG)，下游引物5'端引入XhoⅠ酶切位點(CTCGAG)，序列如下:EVPLS(上游):5＇-GGAATTCCATATGGATAGGGTGGCAGATGTAAT-3＇; EVPLA(下游):5＇-CCGCTCGAGGTTGGCTTTGAAT-AGGTAGTT-3＇。引物由北京博尚生物技術有限公司合成。

1.3 EV71總RNA提取及目的基因擴增 常規培養RD細胞，待細胞生長成單層后以感染復數量(M.O.I)＞5的 EV71接種細胞，待細胞病變達90%時收獲。棄培養上清，RNA提取試劑盒提取RNA并以其為模板進行反轉錄，體系為20 μl，混勻后置37℃、60 min。PCR反應體系為25 μl，反應條件為94℃預變性3 min，94℃、30 s，45℃、30 s，72℃、30 s，32個循環;72℃延伸10 min。取擴增產物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，DNA凝膠電泳回收試劑盒回收目的帶。

1.4 表達載體pET30a(+)-VP1構建 將上述回收片段連接于pMD18-T載體，轉化TOP10感受態菌株，提取質粒做NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定并委托北京博尚生物技術有限公司測序。將片段與經相同雙酶切的 pET30a(+)質粒連接、轉化 Transetta (DE3)感受態菌株。用PCR方法進行鑒定。

1.5 目的蛋白鑒定 挑取PCR鑒定陽性菌落接種于5 ml LB培養液中，37℃劇烈震蕩培養16 h，以1∶100轉接于新鮮LB培養液中，37℃劇烈震蕩培養至A600約為0.8，加入終濃度為1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)繼續37℃劇烈震蕩培養4 h，取1 ml菌液，4 000 rpm離心10 min收集菌體，加入去離子水和2×SDS蛋白凝膠加樣緩沖液各100 μl重懸，煮沸10 min，12 000 rpm離心10 min。取上清液20 μl與蛋白Marker同時行SDSPAGE電泳，用考馬斯亮藍R250染色，脫色液脫色后觀察有無目的條帶。

1.6 重組蛋白表達鑒定 采用Western Blot法。十二烷基硫酸鈉—聚丙稀酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)后，電轉移至硝酸纖維膜，5%脫脂奶粉封閉，先后加臨床陽性血清、羊抗人IgM-HRP，反應條件均為37℃、2 h。洗膜后以DAB顯色，出現棕色條帶者判為陽性。

1.7 重組蛋白表達條件優化 分別在20、30和37℃下，采用濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/ L的IPTG，對目的蛋白進行1、2、4、6 h的誘導表達。取樣進行SDS-PAGE電泳，用Bandscan軟件分析表達蛋白占總蛋白的百分比，根據結果確定重組蛋白的最佳表達條件。

2 結果

2.1 目的基因擴增 RT-PCR擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳，在857 bp處獲得特異性條帶，與預期目的基因VP1蛋白的同源率均在99%以上，與2008年的安徽阜陽分離株相同區段的VP1蛋白氨基酸序因大小一致(圖1)。測序結果在NCBI網站上進行BLAST比對，與大部分EV71列(GenBank: ACD63039)的同源率為100%。

2.2 表達載體pET30a(+)-VP1的構建與鑒定

重組質粒pET30a(+)-VP1經NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切后，進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，在831 bp、5 422 bp獲得電泳帶，大小與VP1及載體片段長度一致(圖2)。

2.3 目的蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳 SDS-PAGE凝膠電泳結果顯示，含重組質粒的誘導菌在相對分子質量約為30 kD處出現一強蛋白條帶，而空載體菌在相應位置未出現該蛋白條帶(圖3)。

2.4 重組蛋白Western Bolt鑒定 以陽性血清為一抗，羊抗人IgM為二抗進行Western blot，結果顯示表達的融合蛋白在30kD處出現陽性條帶，而空載體菌對照與陽性血清無反應(圖4)。

2.5 重組蛋白表達優化條件 在37℃，采用濃度為1.0 mmol/L的IPTG誘導4 h效果最好。

3 討論

20世紀90年代開始，EV71在亞太地區的流行有上升趨勢。進入2009年以后，除西藏外，我國30個省份均有病例發生，主要集中于河南、山東、江蘇、廣西、安徽等省，危重病例較往年增加。VP1、VP2和VP3三個多肽暴露在病毒外殼的表面，而VP4包埋在病毒外殼的內側與病毒核心緊密連接。其中VP1被認為有著最多的抗原決定簇［2］，是主要的病毒中和決定因子，直接決定病毒的抗原性，在疫苗研發和診斷試劑盒開發方面有廣泛的應用前景。

目前已經有相當多的研究證實了VP1蛋白作為抗原用于診斷和疫苗預防的有效性。Foo等［3］僅利用VP1蛋白上的一段多肽序列就在小鼠模型中觀察到了良好的免疫保護反應。Chen等［4］構建了能夠表達VP1的轉基因番茄，小鼠口服后血清中檢測到了EV71的特異性抗體。Chen HL和他的研究小組［5］則通過制備轉基因小鼠的方式使重組VP1蛋白出現在母鼠的乳汁中，動物進食這種乳汁可產生有效的免疫保護反應。Chiu等［6］采用減毒的鼠疫沙門氏菌展示表達了VP1蛋白并將其作為疫苗，其免疫保護作用在小鼠模型的實驗中得到了證實。本研究選擇EV71結構蛋白VP1第2-274aa在大腸桿菌表達系統中進行克隆表達并對其抗原性進行初步鑒定，進而確定蛋白表達的最佳條件為30℃、0.6 mmol/L IPTG，誘導表達4 h。

本研究成功表達并鑒定了EV71 VP1抗原;為EV71疫苗研制及檢測試劑盒的建立奠定了基礎。

［1］Ishimaru Y，Nakano S，Yamaoka K，et al.Outbreaks of hand，foot，and mouth disease by enterovirus 71.High incidence of complication disorders of central nervous system［J］.Arch Dis Child，1980，55 (8):583-588.

［2］Shih SR，Li YS，Chiou CC，et al.Expression of capsid［correction of caspid］protein VP1 for use as antigen for the diagnosis of enterovirus 71 infection［J］.J Med Virol，2000，61(2):228-234.

［3］Foo DG，Alonso S，Chow VT，et al.Passive protection against lethal enterovirus 71 infection in newborn mice by neutralizing antibodies elicited by a synthetic peptide［J］.Microbes Infect，2007，9 (11):1299-1306.

［4］Chen HF，Chang MH，Chiang BL，et al.Oral immunization of mice using transgenic tomato fruit expressing VP1 protein from enterovirus 71［J］.Vaccine，2006，24(15):2944-2951.

［5］Chen HL，Huang JY，Chu TW，et al.Expression of VP1 protein in the milk of transgenic mice:a potential oral vaccine protects against enterovirus 71 infection［J］.Vaccine，2008，26(23):2882-2889.

［6］Chiu CH，Chu C，He CC，et al.Protection of neonatal mice from lethal enterovirus 71 infection by maternal immunization with attenuated Salmonella enterica serovar Typhimurium expressing VP1 of enterovirus 71［J］.Microbes Infect，2006，8(7):1671-1678.