前癃通膠囊對人前列腺組織bcl-2、bax表達的影響

蔡蔚 袁軼峰 賀菊喬 伍參榮

（1湖南中醫藥大學第一附屬醫院 長沙 410007；2湖南中醫藥大學 長沙 410007）

前癃通膠囊對人前列腺組織bcl-2、bax表達的影響

蔡蔚1袁軼峰1賀菊喬1伍參榮2

（1湖南中醫藥大學第一附屬醫院 長沙 410007；2湖南中醫藥大學 長沙 410007）

目的：檢測前癃通對前列腺組織bcl-2、bax表達的影響。方法：（1）免疫組化法檢測前癃通對體外培養BPH患者前列腺組織bcl-2、bax蛋白表達的影響。（2）RT-PCR法檢測前癃通對體外培養BPH患者前列腺組織塊細胞bcl-2 mRNA、bax mRNA基因表達的影響。結果：前癃通高、中劑量組對前列腺組織bcl-2蛋白、bcl-2 mRNA基因的表達有不同程度的抑制作用，對bax蛋白、bax mRNA基因的表達有不同程度的增強作用。結論：前癃通對前列腺組織能抑制bcl-2的基因表達，增強bax的基因表達，從而抑制前列腺增生。

良性前列腺增生癥；前癃通膠囊；前列腺組織；bcl-2；bax

前癃通膠囊是我們根據氣虛血瘀理論，臨床應用多年治療良性前列腺增生癥（BPH）的經驗方，在多年的臨床運用中取得了較好的療效。本研究旨在前期工作的基礎上，借助現代分子生物學技術，進一步探討前癃通膠囊對BPH患者體外培養前列腺組織細胞bcl-2、bax表達的影響，為前癃通膠囊的療效評價進一步提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 前列腺組織的培養 在手術室無菌條件下，經恥骨上前列腺摘除術切除的新鮮前列腺標本迅速放入在4℃冰箱中預冷的組織洗滌液內，冰浴狀態下帶回實驗室。在2 h內開始組織消化。參照文獻

[1～2]，經前列腺組織處理、培養液潤洗、接種，逐日觀察培養組織，至組織塊之間的細胞互相融合，即可直接用于實驗研究。

1.2 實驗藥物及分組

1.2.1 實驗藥物及制備 前癃通膠囊：由黃芪、丹參、三七、穿山甲、王不留行等藥物組成，由湖南中醫藥大學第一附屬醫院制劑室提供，批號000605，每粒0.5 g（含生藥0.5 g）。取前癃通膠囊50 g，加入Hank's液溶解，用組織培養液配制成1 g/mL，1 500 rpm離心去除沉淀，用0.22 μm微孔濾膜濾過除菌，4℃保存備用。他莫昔芬（口服片）：由山東健康藥業有限公司生產，批號：1210016，10 mg/片。取他莫昔芬20 g，用Hank's液溶解,用組織培養液稀釋配制成1 ng/mL，用0.22 μm微孔濾膜濾過除菌，4℃保存備用。

1.2.2 藥物對培養組織的毒作用 取上述制備好的前癃通膠囊藥液，用1 640培養液幾何比稀釋成25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78 mg/L濃度，生物光學倒置顯微鏡下觀察前癃通膠囊對培養的前列腺組織的毒性作用。結果6.25、3.13、1.56 mg/L組對細胞的毒性作用小于制定標準，因此選擇作為試驗用藥濃度。

1.2.3 實驗分組 依據上述實驗結果，選擇形態良好、長滿單層的組織培養物隨機分為：模型對照組（即空白組）、他莫昔芬組、前癃通高劑量組（6.25 mg/L）、前癃通中劑量組（3.13 mg/L）和前癃通低劑量組（1.56 mg/L）。

1.3 SABC法檢測各組bcl-2、bax蛋白表達

1.3.1 實驗材料 （1）bcl-2試劑盒（湖南麗欣生物公司）；（2）bax試劑盒（湖南麗欣生物公司）；（3）DAB試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；（4）即用型SABC免疫組化染色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司)；（5）鼠抗人bcl-2單克隆抗體系（武漢博士德生物工程有限公司）；（6）鼠抗人bax單克隆抗體系（武漢博士德生物工程有限公司）；（7）山羊抗兔IgG（武漢博士德生物工程有限公司）；（8）PBS（湖南麗欣生物公司）。

1.3.2 實驗方法 （1）載玻片防脫片處理：選擇APES，撈片后置烤箱60℃30～60 min以使切片緊密粘附。（2）切片脫蠟至水，30%H2O21份+蒸餾水10份混合，室溫5～10 min以滅活內源性酶。蒸餾水洗3次。（3）微波修復抗原：將切片浸入0.01 M枸櫞酸鹽緩沖液，PH 6.0，電爐或微波爐加熱至沸騰后斷電，間隔5～10 min，重復1～2次，冷卻后進行下一步。（4）滴加山羊血清封閉液，室溫20 min。甩去多余液體，不洗。（5）滴加鼠抗bcl-2抗體，37℃1～2 h。PBS（PH 7.2～7.6）洗2 min×3次。（6）滴加生物素化山羊抗兔IgG，20～37℃20 min，PBS（PH 7.2～7.6）洗2 min×3次。（7）滴加試劑SABC，20～37℃20 min，PBS（PH 7.2～7.6）洗5 min×4次。（8）DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒。取1 mL蒸餾水，加試劑盒中A、B、C試劑各1滴，混勻后加至切片。室溫顯色，鏡下控制反應時間，一般5～30 min，蒸餾水洗滌。（9）蘇木素輕度復染，脫水，透明，封片。顯微鏡觀察。觀察方法：在10×40倍視野下隨機計數5個視野的bcl-2陽性細胞數（棕黃色顆粒），取其均值。bax具體操作步驟同bcl-2。

1.4 RT-PCR法測定各組bcl-2 mRNA、bax mRNA基因表達

1.4.1 主要試劑 （1）Trizol試劑盒：上海生工生物工程技術服務有限公司提供。（2）β-actin、bcl-2、bax引物：由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。（3）逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）試劑盒：上海生工生物工程技術服務有限公司提供。

1.4.2 主要儀器 （1）PCR基因擴增儀：TC-48/T/H（a）杭州大和株式會社；（2）天能凝膠成像系統(Tanon GISgel in aging system)：上海天能生物有限公司；（3）TGL16臺式高速冷凍離心機：湖南湘儀；（4）電泳儀：杭州大和株式會社。

1.4.3 β-actin、Bcl-2和 Bax引物序列 β-actin mRNA：sense:5-TTGGCACCACACTTTCTACA-3'；antisense：5’-TCACGCACGATTTCCCTCTCA-3’；擴增片段長度442 bp。β-actin作為“看家基因”監控RNA使用量，以消除不同樣本間加樣誤差。Bcl-2 mRNA：sense:5’-CCATGTGTCCATCTGACC-3’；antisense：5’-GCCATATAGTTCCACAAA-3’；擴增片段長度330 bp。Bax mRNA：sense:5’-CTAGCA AACTGGTGCTCAAGG-3’；antisense：5’-CGAAGT AGGAGAGGAGGCCT-3’；擴增片段長度147 bp。

1.4.4 總RNA的提取 參考文獻[3]。（1）取10 mg低溫保存的前列腺組織塊加1 mL酚和異硫氰酸胍的均相溶液(Trizol)，機械勻漿，吹打混勻；（2）將勻漿液轉至1.5 mL滅菌管中，室溫靜置15 min；（3）加入0.2 mL氯仿，輕搖震蕩15 s，室溫靜置2 min；（4）4℃、12 000 rpm離心15 min，取上清；（5）將上清水相（約1 mL）移入新的EP管，加入異丙醇0.5 mL，將管內液體輕輕混勻，室溫靜置10 min；（6）4℃、12 000 rpm離心10 min，傾倒棄上清；（7）加入75%乙醇1 mL，清洗EP管，吹打混勻，4℃、7 500 rpm離心5 min，棄上清，重復1次；（8）所得RNA用紫外分光光度法定量，并于－70℃保存備用。

1.4.5 PCR擴增 50 mL反應體系中含有2× RT-PCR Buffer 25μL，模板RNA X μL(含量為1 μg)，β-actin、bcl-2和 bax上下游引物各 1 μL，RT/Taq Mix 1μL，其余體積為DEPC水。循環參數：（1）β-actin為94℃2 min，94℃50 s，55℃50 s，72℃1 min，35個循環，72℃5 min；（2）bcl-2為94℃2 min，94℃30 s，50℃30 s，72℃1 min，35個循環，72℃5 min；（3）bax為94℃2 min，94℃30 s，59℃45 s，72℃45 s，30個循環，72℃5 min。以上均采用熱啟動方式，預變性后，于72℃條件下加入Taq DNA聚合酶。

1.4.6 PCR產物電泳鑒定 RT-PCR后的DNA產物加入染料后離心1 000 rpm×30 s，充分振蕩，取10 μL于115%瓊脂糖凝膠電泳，100 V，1 h，EB染色，紫外燈下拍照。

1.4.7 圖像分析 采用天能凝膠成像系統測定PCR產物電泳密度。各基因mRNA表達強度以其PCR產物電泳密度值與看家基因β-actin的比值(bcl-2/β-actin、bax/β-actin)來表示。

1.5 統計方法 結果以均數±標準差 (±S)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用q檢驗（用SPSS軟件統計分析）。

2 結果

2.1 各組bcl-2蛋白表達的結果 他莫昔芬組和前癃通高、中劑量組對bcl-2蛋白的表達有不同程度的抑制作用，與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.01、P＜0.05），低劑量組與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；高、中劑量組與他莫昔芬組比較，無統計學意義（P＞0.05）。結果見表1。

表1 免疫組化法檢測bcl-2蛋白表達的指數 (±S)

表1 免疫組化法檢測bcl-2蛋白表達的指數 (±S)

注：與模型組比較：○P＜0.05，●P＞0.05，△P＜0.01；與他莫昔芬組比較：▲P＞0.05；與低劑量組比較：☆P＞0.05，★P＜0.05；與中劑量組比較：□P＞0.05。

組別 n bcl-2模型組 5 11.60±2.07他莫昔芬組 5 9.20±1.48○低劑量組 5 10.40±1.52●▲中劑量組 5 8.80±0.84○▲☆高劑量組 5 7.80±1.79△▲★□

2.2 各組bax蛋白表達的結果 他莫昔芬組和前癃通高、中劑量組對bax蛋白的表達有不同程度的增強作用，與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.01），低劑量組與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；高劑量組與他莫昔芬組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），與中劑量組比較有統計學意義（P＜0.05）。結果見表2。

表2 免疫組化法檢測bax蛋白表達的指數 (±S)

表2 免疫組化法檢測bax蛋白表達的指數 (±S)

注：與模型組比較：▲P＜0.01，○P＞0.05；與他莫昔芬組比較：●P＜0.01，☆P＞0.05；與低劑量組比較：★P＞0.05，□P＜0.01；與中劑量組比較：■P＜0.05。

組別 n bax模型組 5 9.20±0.84他莫昔芬組 5 13.80±1.48▲低劑量組 5 10.60±0.55○●中劑量組 5 11.20±1.48▲●★高劑量組 5 13.00±0.71▲☆□■

2.3 各組bcl-2 mRNA基因表達的結果 他莫昔芬組和前癃通高、中劑量組對bcl-2 mRNA的表達有不同程度的抑制作用，與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.01、P＜0.05），低劑量組與模型組比較，對bcl-2 mRNA作用不明顯，差異無統計學意義（P＞0.05）；高、中劑量組與他莫昔芬組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。結果見表3。

表3 前癃通對前列腺組織bcl-2 mRNA表達的影響 (±S)

表3 前癃通對前列腺組織bcl-2 mRNA表達的影響 (±S)

注：與模型組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與他莫昔芬組比較：△P＞0.05，△△P＜0.01；與低劑量組比較：#P＞0.05，##P＜0.05。

組別 n bcl-2 mRNA模型組 5 17.46±3.18△△##他莫昔芬組 5 13.35±2.64**#低劑量組 5 15.74±4.23中劑量組 5 14.25±3.86*△#高劑量組 5 12.76±3.31**△##

2.4 各組bax mRNA基因表達的結果 他莫昔芬組和前癃通高、中劑量組對bax mRNA的表達有不同程度的增強作用，與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05、P＜0.01），低劑量組與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；高劑量組與他莫昔芬組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），與低劑量組差異有統計學意義（P＜0.05）。結果見表4。

表4 前癃通對前列腺組織細胞bax mRNA表達的影響 (±S)

表4 前癃通對前列腺組織細胞bax mRNA表達的影響 (±S)

注：與模型組比較：*P＞0.05，**P＜0.05，***P＜0.01；與他莫昔芬組比較：△P＞0.05，△△P＜0.05；與低劑量組比較：#P＞0.05，##P＜0.05。

組別 n bax mRNA模型組 5 14.12±2.92△△#他莫昔芬組 5 17.85±3.51**#低劑量組 5 15.43±2.13*△中劑量組 5 17.42±4.22**△#高劑量組 5 18.82±3.58***△##

3 討論

前癃通膠囊是我們臨床應用多年治療良性前列腺增生的經驗方，具有益氣利水、活血散結之功效。經臨床應用證實[4]，該藥療效確切，實驗研究顯示，該藥對大鼠前列腺基底細胞凋亡有影響。本實驗通過觀察該藥對BPH患者體外培養前列腺組織bcl-2、bax表達的影響，進一步從細胞分子水平探討前癃通膠囊的作用機制。

以往的研究發現增生前列腺組織的細胞凋亡水平明顯低于正常前列腺組織，引起前列腺細胞凋亡的調控基因有bcl-2、bax、fax、C-myc、P 53等。在參與調控細胞凋亡的基因中bcl-2蛋白家族是最重要的凋亡調節因子，bcl-2和bax又分別是其中主要的抗凋亡和促凋亡成員。研究表明[5]，bcl-2基因主要在前列腺基底上皮細胞中表達，說明前列腺增生時由于bcl-2對上皮細胞發揮凋亡作用，可使前列腺上皮細胞壽命延長，凋亡數目減少。Colombel等[6]通過免疫組化研究發現，bcl-2表達于前列腺移行帶、外周帶和中央帶的基底上皮細胞，在BPH中強陽性表達。bcl-2的抗凋亡作用使前列腺基底細胞增殖與凋亡失衡而引起前列腺增生。謝慶祥等[7]研究表明BPH中bcl-2異常高表達，提示bcl-2表達增強而導致細胞凋亡的減少在BPH的發生過程中起重要作用，與本研究結果一致。

bax是一個水溶性蛋白，與bcl-2蛋白大約有21%的同源性，其過量表達可抑制bcl-2功能而促進細胞凋亡。研究表明[8]，前列腺上皮和間質中見bax表達，提示bax對上皮和間質細胞凋亡均有調控功能，BPH上皮細胞bax表達減少，提示其促進上皮細胞凋亡的功能亦降低，從而導致上皮細胞凋亡減少，引起上皮細胞聚集、增生，表明bax參與BPH的上皮增生形成過程，而BPH間質細胞中bax表達與正常者無明顯差異，甚至呈增加趨勢，推測bax在BPH的間質增生過程中作用并不重要。

本實驗結果表明，前癃通膠囊能抑制體外培養前列腺組織bcl-2的蛋白及其基因表達，同時又能增強bax蛋白及其基因的表達，促進細胞凋亡。其治療前列腺增生癥的機理可能是通過對凋亡因子的調控，調節bcl-2和bax基因，促使細胞凋亡而起作用。

[1]鄂征.組織培養和分子細胞學技術[M].北京:北京出版社,2001. 35-38

[2]司徒鎮強,吳軍正.細胞培養[M].西安:興界圖書出版社,2003.22-77

[3]劉文革,林佳俊,王鋒,等.RT-PCR檢測bFGF對脊髓損傷后bcl-2、bax基因的表達[J].福建醫科大學學報,2005,39(3):281-283

[4]蔡蔚,朱閩,周青,等.前癃通膠囊治療良性前列腺增生癥36例臨床觀察[J].中醫藥導報,2008,14(6):74-76

[5]祝海,孫小慶,周榮祥,等.凋亡抑制基因bcl-2在前列腺組織中的表達[J].中華泌尿外科雜志,2002,23(5):301-303

[6]Colombel M,Vacherot F,Diez SG,et al.Zonal variation of apoptosis and protiferation in the mormal prostase and in benign prostatic hyperpla-Sia[J].Br J urol,1998,82:380-385

[7]謝慶祥,汪鴻,繆友仁,等.細胞凋亡相關基因bcl-2和bax在前列腺增生組織中表達的意義[J].中華泌尿外科雜志,1998,19(2):98-100

[8]鄧方明,顧方六,夏同禮,等.人良性前列腺增生細胞增殖和凋亡狀態的研究[J].中華外科雜志,1996,34(10):620

Objective:To explore the influence of Qian-long-tong capsule on the expressions of bax,bcl-2 in prostatic tissue.Methods: (1)Immunity histochemistry analysis was used to explore the influence of Qian-long-tong capsule on the expressions of bcl-2 protein and bax protein in prostatic tissue mass.(2)RT-PCR was used to examine the effect of Qian-long-tong capsule on expressions of bcl-2 mRNA gene and bax mRNA gene.Results:During high and medium dose groups of Qian-long-tong capsule,there were different degree of inhibitory action on the expressions of bcl-2 protein and bcl-2 mRNA gene,while enhancement action on the expression of bax protein and bax mRNA gene.Conclusion:Qian-long-tong capsule can inhibit the expression of bcl-2 gene,enhance the expression of bax gene thus inhibit the hyperplasia of prostate tissue.

Benign Prostate Hyperplasia（BPH）;Qian-long-tong capsule;Prostatic tissue mass;bcl-2 gene;bax gene

R 697.3

B

10.3969/j.issn.1671-4040.2011.01.001

2010-07-21）