HPLC-MS/MS法鑒定落新婦苷在大鼠尿中的代謝產物

王文艷,仝瑤瑤,張林琪,宋吉倫,李貴生,,劉萬卉

(1.煙臺大學藥學院,山東煙臺 264005;2.山東綠葉制藥天然藥物研究中心,山東煙臺 264005)

HPLC-MS/MS法鑒定落新婦苷在大鼠尿中的代謝產物

王文艷1,仝瑤瑤1,張林琪1,宋吉倫2,李貴生1,2,劉萬卉1

(1.煙臺大學藥學院,山東煙臺 264005;2.山東綠葉制藥天然藥物研究中心,山東煙臺 264005)

為鑒定大鼠給藥落新婦苷后尿中的主要代謝產物,收集其尿樣,用聚酰胺固相萃取小柱處理后進樣,采用高效液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS/MS)法分析。電噴霧離子源在負離子模式下進行掃描,借助碰撞誘導解離方式進行落新婦苷在大鼠體內主要代謝產物的結構確證。共鑒定出6個落新婦苷在大鼠尿中的代謝產物,分別為落新婦苷異構體(M1)、3′-O-甲基化落新婦苷(M2)、3′-O-甲基化落新婦苷異構體(M3)、槲皮素-鼠李糖苷(M4)、葡萄糖醛酸化落新婦苷 (M5)、3′-O-甲基化落新婦苷-葡萄糖醛酸化物(M6)。該方法對落新婦苷在大鼠體內的代謝進行了初步研究,并報道了落新婦苷在大鼠尿中的另外4個代謝產物M1、M3、M4、M6。

落新婦苷;代謝產物;高效液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS/MS);聚酰胺固相萃取小柱

落新婦苷(3-O-α-l-鼠李糖-5,7,3′,4′-4 羥基二氫黃酮醇)為中藥材土茯苓的提取物[1-2]。研究發現,落新婦苷在體內外有許多有益的藥理藥效作用,如抗菌活性[3]、免疫抑制活性[4]、抑制肝癌細胞系的擴增[5]。另外,落新婦苷有類似于刀豆蛋白A的抗炎作用,但沒有副作用[6]。有研究報道了落新婦苷單劑量靜注給藥或灌胃給藥兔子后的藥動學特性[7]。落新婦苷灌胃給藥后迅速被吸收,生物利用度低于10%。有學者以99 mg/kg劑量灌胃給藥大鼠后,在鼠尿中鑒定出落新婦苷的代謝產物為 3′-O-甲基-落新婦苷[8]。為了更全面的了解落新婦苷的體內代謝情況,我們進行了大鼠靜注給藥落新婦苷(10 mg/kg)后的代謝途徑研究。鼠尿樣經自制的聚酰胺固相萃取小柱處理后,采用高效液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS/MS)法進行檢測,通過色譜及質譜數據推測代謝物的結構。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

Agilent 1100 HPLC:美國安捷倫公司產品,配有在線脫氣機、四元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱和VWD檢測器;TSQ Quantum Access三重四極桿質譜儀:美國 ThermoFisher公司產品,配有電噴霧離子源及Xcalibur1.4數據處理系統。

1.2 主要材料與試劑

落新婦苷(純度＞98%):由山東綠葉制藥天然藥物研究中心提供;甲醇(色譜純):德國Merck公司產品;試驗用水為去離子雙蒸水;聚酰胺(粒徑30～50μm):購自北京百靈威化學技術有限公司。

1.3 動物實驗

5只(235±11)g雄性 SD大鼠:由山東綠葉制藥有限公司實驗動物中心提供。動物飼養在代謝籠中,水和食物可以自由獲得。每只鼠尾靜脈注射給藥 10 mg/kg落新婦苷,給藥前(-12～0 h)收集空白尿樣,給藥后(0～12 h)收集尿樣,收集到尿樣后立即儲存于-20℃冰箱中 ,待測。

1.4 實驗條件

1.4.1 色譜條件 Supelco Discovery C 18色譜柱(150 mm×2.1 mm×5μm),柱溫30 ℃。以90%甲醇作為A相,5%甲醇作為B相,按如下設置進行梯度洗脫:0 min,100%B;6 min,90%B;12 min,60%B,保持 2 min;20 min,5%B,保持 3 min;24 min,100%B,保持7 min。紫外檢測波長設置為290 nm。

1.4.2 質譜條件 電噴霧離子源負離子檢測模式,噴霧電壓3 500 V,鞘氣壓力2.41×105Pa;輔氣壓力3.45×104Pa,毛細管溫度350℃,碰撞誘導解離電壓23 V,氬氣壓力0.2 Pa。

1.5 樣品處理

尿樣在冰水浴中融化后,8 000 r·min-1離心10 min,聚酰胺固相萃取小柱(200 mg)依次用4 mL甲醇活化和4 mL水平衡,然后將1 mL尿樣上樣到小柱上,再用2 mL水和4 mL甲醇洗脫小柱,收集甲醇洗脫相,在40℃用氮氣流吹干。殘留物用50%甲醇水復溶后,10μL進樣,HPLC-MS/MS分析。

2 結果與討論

2.1 HPLC-MS/MS鑒定落新婦苷的代謝產物

為了消除內源性物質的干擾,鼠尿樣用自制的聚酰胺固相萃取小柱處理,聚酰胺基質處理含有羥基或羧基基團的化合物。與采用0.45μm濾膜過濾或乙腈沉淀蛋白預處理的尿樣方法比較,采用聚酰胺固相萃取小柱處理尿樣后,明顯減少了基質干擾,并且有利于減少樣品對質譜儀器的污染。高靈敏度的 ESI電離源結合串聯四極質譜為推斷落新婦苷代謝物的結構特性提供了信息?？瞻啄驑蛹奥湫聥D苷尿樣的典型HPLC-UV色譜圖和 TIC(總離子流)圖示于圖1。與空白尿樣比較,靜注給藥落新婦苷后,在鼠尿樣中可發現落新婦苷(M0)及其6個代謝產物M1～M6。

圖1 尿樣經SPE預處理后的 HPLC-UV和TIC圖a.空白鼠尿;b.添加落新婦苷標準品的空白鼠尿;c.靜注給藥落新婦苷后的鼠尿樣Fig.1 HPLC-UVand TIC chromatograms of SPE extract a.blank rat urine;b.blank rat urine spiked with an astilbin standard;c.urine sample after intravenous administration of astilbin

2.2 落新婦苷M0及其代謝產物M1

負離子電噴霧質模式下,掃描落新婦苷的準分子離子峰為[M-H]-m/z449,色譜保留時間為18.4 min,經碰撞誘導解離(CID),其產生的碎片離子為m/z303、285、179及151,示于圖2。m/z449丟失鼠李糖(Rha,146,C6H10O4)產生碎片離子m/z303,其進一步碎裂產生碎片離子m/z285和m/z179,分別丟失了 18 u(H2O)和124 u(C6H4O3)。m/z179進一步碎裂產生m/z151,丟失28 u(CO)。代謝物M1的色譜保留時間為19.5 min,其裂解過程及產生的碎片與落新婦苷一致,所以推斷M1為落新婦苷的同分異構體。落新婦苷及其代謝產物M1的二級質譜裂解途徑示于圖3。有研究報道,在土茯苓提取物中,落新婦苷還有3個同分異構體,分別為新落新婦苷、異落新婦苷、新異落新婦苷[9-10]。本實驗發現,落新婦苷在體內可以轉化為它的同分異構體。

2.3 落新婦苷代謝產物M2和M3

落新婦苷代謝產物M2、M3的色譜保留時間分別為20.2 min和 20.9 min,它們的準分子離子峰為[M-H]-m/z463,比落新婦苷[MH]-的m/z高14 u,經碰撞誘導解離反應產生一系列的碎片離子,分別為m/z317、299、289、179和151,示于圖4。m/z463丟失 Rha產生碎片離子m/z317,其進一步碎裂產生m/z299、289和 179碎片離子,它們分別丟失 18 u(H2O),28 u(CO)和138 u(C2H2O)。m/z179丟失28 u(CO)產生碎片離子m/z151。結果表明,M2和M3分別是落新婦苷及其同分異構體的甲基化產物。有文獻[8]鑒定,落新婦苷灌胃給藥大鼠后,鼠尿中的甲基化代謝產物為3′-O-甲基-落新婦苷。落新婦苷及其同分異構體的甲基化代謝物的質譜裂解途徑示于圖5。

圖2 落新婦苷及其異構體(M0,M1,m/z449)的 HPLC-MS/MS圖a.掃描質譜圖;b.SIM色譜圖;c.CID碎片離子Fig.2 HPLC-MS/MS spectrum of astilbin and its stereoisomer(M0 and M1,m/z449)a.mass scan spectra;b.selected ion monitoring(SIM)chromatogram;c.CID product ion spectra

圖3 落新婦苷m/z449離子的可能裂解機理Fig.3 Proposed decomposition process ofm/z449[M-H]-ion of astilbin

2.4 落新婦苷代謝產物M4

代謝產物M4的準分子離子峰為[M-H]-m/z447,色譜保留時間為17.4 min。經碰撞誘導解離后產生的碎片離子m/z301,它是m/z447丟失Rha產生的,示于圖6。m/z447比落新婦苷[M-H]-的m/z少2 u,即m/z449丟失2 u(H2)。因此推斷落新婦苷在體內進行了脫氫反應,這樣二氫黃酮苷氧化為黃酮苷,推斷M4為槲皮素-鼠李糖苷,并且有文獻[11]報道槲皮素-鼠李糖苷的多反應監測離子對為m/z447/301,這與圖 6c中m/z447的 CID圖譜相符。

2.5 落新婦苷代謝產物M5

代謝產物M5的液相色譜保留時間為12.6 min,準分子離子峰為[M-H]-m/z625,比落新婦苷[M-H]-的m/z高176 u,示于圖7。經碰撞誘導解離M5產生一系列的碎片離子m/z449、303和285,相應為落新婦苷[M-H]-及其碎片的質譜峰,而且葡萄糖醛酸基團的特征峰為m/z176,因此代謝物M5鑒定為葡萄糖醛酸化落新婦苷。文獻[8]報道大鼠灌胃給藥落新婦苷后,在鼠膽汁中發現了葡萄糖醛酸化落新婦苷,但在血漿和尿樣中未發現該代謝物。

圖6 槲皮素-鼠李糖苷(M4,m/z447)的 HPLC-MS/MS圖a.掃描質譜圖;b.SIM色譜圖;c.CID碎片離子Fig.6 HPLC-MS/MS spectrum of quercetin rhamnoside(M4,m/z447)a.mass scan spectra;b.selected ion monitoring(SIM)chromatogram;c.CID product ion spectra

圖7 葡萄糖醛酸化落新婦苷(M5,m/z625)的 HPLC-MS/MS圖a.掃描質譜圖;b.SIM色譜圖;c.CID碎片離子Fig.7 HPLC-MS/MS spectrum of astilbin glucuronide(M5,m/z625)obtained using negative ion electrospray and CID a.mass scan spectra;b.selected ion monitoring(SIM)chromatogram;c.CID product ion spectra

2.6 落新婦苷代謝產物M6

代謝產物M6的液相色譜保留時間為13.5 min,其準分子離子峰為 [M-H]-m/z639,比甲基化落新婦苷[M-H]-高176 u。經碰撞誘導解離后,M6產生一系列碎片離子m/z463、317、299和289,它們為甲基化落新婦苷及其碎片的離子峰,示于圖8。因此,推斷代謝物 M6為甲基化落新婦苷的葡萄糖醛酸化物,即3′-O-甲基-落新婦苷-葡萄糖醛酸化物。

圖8 甲基化落新婦苷的葡萄糖醛酸化物(M5,m/z639)的 HPLC-MS/MS圖a.掃描質譜圖;b.SIM色譜圖;c.CID碎片離子Fig.8 HPLC-MS/MS spectrum of methylastilbin glucuronide(M6,m/z639)a.mass scan spectra;b.selected ion monitoring(SIM)chromatogram;c.CID product ion spectra

3 結論

落新婦苷靜脈注射給藥大鼠后,鼠尿樣經聚酰胺固相萃取小柱處理后,采用 HPLC-MS/MS法鑒定的落新婦苷代謝產物主要為落新婦苷異構體 (M1)、3′-O-甲基-落新婦苷 (M2)、3′-O-甲基-落新婦苷異構體(M3)、槲皮素-鼠李糖苷(M4)、葡萄糖醛酸化落新婦苷(M5)和 3′-O-甲基-落新婦苷-葡萄糖醛酸化物(M6)。落新婦苷在大鼠體內的代謝途徑推斷示于圖9。M2和M5有文獻[8]報道,其余4種代謝產物 (M1、M3、M4、M6)未在鼠尿中落新婦苷代謝物的報道中發現,表明落新婦苷在鼠體內除發生了甲基化和葡萄醛酸化代謝反應外,還可進行異構化和脫氫化代謝反應。推測落新婦苷的代謝途徑有助于理解落新婦苷的作用機制,并為以后的臨床試驗提供有益信息。

圖9 落新婦苷在鼠體內的可能代謝途徑Fig.9 Proposed metabolic pathw ay of astilbin in vivo in the rat

[1]易以軍,曹正中,楊大龍,等.土茯苓化學成分研究(Ⅳ)[J].藥學學報,1998,33(11):873-875.

[2]陳廣耀,沈連生,江佩芬.土茯苓中二氫黃酮醇苷的研究[J].中國中藥雜志,1996,21(6):355-357.

[3]MOULARIB,PELLEQUER Y,LBOUTOUNNE H,et al.Isolation and in vitro antibacterial activity of astilbin,the bioactive flavanone from the leaves ofHarunganamadagascariensisLam. ex Poir.(Hypericaceae)[J].J Ethnopharmacol,2006,106:272-278.

[4]CHINEN J,FINKELMAN F,SHEARER W T.Advances in basic and clinical immunology[J].J Allergy Clin Immunol,2006,118:489-495.

[5]SA F,GAO J L,FUNG K P,et al.Anti-proliferative and pro-apoptotic effect ofSmilax glabraRoxb.extract on hepatoma cell lines[J].Chem Biol Interact,2008,171:1-14.

[6]CAI Y,CHEN T,XU Q.Astilbin suppresses collagen-induced arthritis via the dysfunction of lymphocytes[J].Inflamm Res,2003,52:334-340.

[7]GUO J,XU Q,CHEN T.Quantitative determination of astilbin in rabbit plasma by liquid chromatography[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2004,805:357-360.

[8]GUO J,QIAN F,LI J,et al.Identification of a new metabolite of astilbin,3’-O-methylastilbin,and its immunosuppressive activity against contact dermatitis[J]. Clin Chem,2007,53 (3):465-471.

[9]袁久志,竇德強,陳英杰,等.土茯苓二氫黃酮醇類成分研究[J].中國中藥雜志,2004,29(9):867-870.

[10]王映紅,李 磊,張宏桂,等.HPLC-MS與 HPLC-1H-NMR聯用鑒定土茯苓中的二氫黃酮醇苷異構體[J].中國中藥雜志,2008,33(11):1 281-1 284.

[11]潘 見,楊 毅,夏瀟瀟,等.高效液相色譜-串聯質譜測定碭山酥梨中的酚類物質[J].食品科學,2006,27(12):578-581.

Identification of the Major Metabolites of Astilbin in Rat Urine by HPLC-MS/MS

WANG Wen-yan1,TONG Yao-yao1,ZHANG Lin-qi1,SONGJi-lun2,LI Gui-sheng1,2,LIU Wan-hui1
(1.School ofPharmacy,Yantai University,Yantai264005,China;2.Research Center of N atural Medicine of Shandong L uye Pharmaceutical,Yantai264005,China)

To identify the major metabolites of astilbin in rats,urine samples were collected after intragastric administration of astilbin.The urine samples were pretreated by solidphase extraction using polyamide cartridges,and then were analyzed by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS).Electrospray ionization source operated in negative mode for scan and collision induced dissociation were used to elucidate the structures of the major metabolites of astilbin.The data indicated that the main urine metabolites of astilbin are stereoisomers of astilbin(M1),3′-O-methylastilbin(M2),a stereoisomer of 3′-O-methylastilbin(M3),quercetin rhamnoside(M4),astilbin glucuronide(M5),3′-O-methylastilbin glucuronide(M6).Metabolites of M1,M3,M4 and M6 are reported from rat urine.

book=37,ebook=37

astilbin;metabolite;high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS);polyamide solid-phase extraction

O 657.63

A

1004-2997(2011)01-0036-07

2010-01-27;

2010-05-31

王文艷(1976～),女(蒙古族),內蒙古赤峰人,博士,講師,從事藥物代謝動力學研究。

E-mail:wangwenyan345@yahoo.com.cn

劉萬卉(1964～),男(土家族),湖南人,博士,教授,從事藥物分析研究。E-mail:PAL05@ytu.edu.cn