質譜在生物標志物研究中的應用

彭 翱 ,趙 芊 ,江 驥 ,胡 蓓

(中國醫學科學院,北京協和醫院臨床藥理中心,北京 100730)

質譜在生物標志物研究中的應用

彭 翱 ,趙 芊 ,江 驥 ,胡 蓓

(中國醫學科學院,北京協和醫院臨床藥理中心,北京 100730)

生物標志物是一個指示劑,可以對其進行測定并用以解釋正常生理過程、病理過程及治療藥物的藥理學效應,廣泛的應用于藥物研發和臨床診斷中。生物標志物的研究涉及多種技術平臺和方法,其中基于質譜的研究方法無論在生物標志物的發現還是確證過程中都有著廣泛的應用。本文討論了基于質譜的研究方法在通常的生物標志物以及阿爾茨海默氏癥研究中的進展。

質譜;生物標志物;阿爾茨海默氏癥

在過去的10年中,人們對人類疾病的分子基礎有了深入的認識,同時也增加了對治愈致死性疾病(如癌癥)的期望。然而,隨著對疾病認識的增加,新藥研發的復雜性和費用呈指數型增加,導致藥政管理部門批準新化合物實體的停滯。在這種情況下,美國國立衛生研究院(NIH)發表的“路線圖”和美國食品藥品監督管理局(FDA)頒布的“啟動關鍵之路”已經指出:“生物標志物”是目前這種危機的潛在“救星”之一。

生物標志物有這樣一種特征,它作為一個指示劑,可以對其進行測定并用以解釋正常生理過程、病理過程及治療藥物的藥理學效應[1]。因為生物標志物可以更可靠、更早期的預測疾病,增加治療藥物對特定目標人群的選擇性,并允許實時監測,甚至預測治療的療效。對于耗時長、費用高的藥物研發過程來說,生物標志物被認為可用于做出繼續或終止研發的決策。今后,生物標志物的應用會為個體化治療的開展鋪平道路,盡早確定治療的獲益/風險比,以便更好的保護患者免于不當的治療。

1 生物標志物的研究方法

生物標志物的研究工作包括發現階段和驗證階段。當一個生物標志物順利通過確證后,便可以在臨床工作中應用。在傳統的研究模式中,生物標志物的發現工作是在基于質譜的技術平臺上進行的,而驗證及臨床應用工作會采用基于配體分析(LBA)的研究技術,如酶聯免疫分析(ELISA)。這種研究模式在研究效率上顯然并不是很成功,因為它在研究的不同階段需要涉及到2種或2種以上的,且相互獨立的分析方法學。此外,受到關注的是在一些臨床情況下,同時應用多個生物標志物具有更好的特異性,對疾病的診斷更加準確[2-5]。這意味著,如果使用配體分析方法,診斷程序將變得更加復雜,給患者帶來更大的經濟壓力?；谝陨显?將生物標志物的研究工作整合在一種技術平臺上,既避免了分析方法的多重開發,也更適于臨床應用。在眾多的分析方法中,質譜技術無疑是理想的候選之一,然而同樣面臨著相應的挑戰。首先,生物標志物的血清濃度動態范圍很寬,例如高豐度的白蛋白和一些經典的生物標志物前列腺特異抗原(PSA)的濃度可相差108～1 010倍,如果要對這些低豐度蛋白進行準確度和精密度都符合要求的定量,樣本酶解前的預分離是非常重要的。樣本預分離通常采用液相色譜完成,使用反向及親和兩種不同原理的色譜技術去除不相關的高豐度蛋白,保證豐度低的潛在生物標志物的測定不受影響。另一種挑戰來自對翻譯后修飾(PTM)的特殊蛋白的定量分析,主要解決方法包括:親和吸附、對目標病變組織分析,穩定同位素標記技術(ICAT,iTRAQ)。生物標志物研究的不同階段的質譜方法和技術列于表1。

表1 生物標志物研究的主要階段以及涉及到的質譜方法和技術Table 1 The biomarker development pathw ay,indicating the nature of the analysis in the three phases of discovery,validation and clinical application

生物標志物的確證對獲得合格的生物標志物以及將其成功應用到臨床工作中是至關重要的。在歐洲,所有收集受試者標本進行生物標志物測定的臨床試驗都必須報告管理當局,實驗室的測定過程被要求依從全面的質量控制。為落實當局的要求,生物標志物的分析不得不經歷全面的方法學考核。美國藥學科學家協會(AAPS)和美國臨床配體分析協會(CLAS)將生物標志物的分析方法分為以下4類[6-8]:1)絕對定量分析使用標準曲線和回歸模型來計算未知樣本中的絕對定量值,其中標準品能夠完全體現和代表生物標志物;2)使用響應-濃度標準曲線進行相對定量分析,但標準品不能完全代表生物標志物;3)半定量分析中不采用標準曲線,但是待測樣本能夠以連續響應結果進行表達;4)定性分析可以是定序結果(ordinal data),如免疫組化,或者是適用于判斷是/否的定類結果(nominal data)。不同生物標志物分析需要對不同的指標進行驗證,目前對不同類型的生物標志物分析所需要的考核內容列于表2。在生物標志物的方法學考核中,有兩種基本生物分析指導原則可以參考:其一是FDA頒布的適用于藥物生物分析的指導原則;另一個是美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)和臨床實驗室改進法案(CLIA)頒布的適用于臨床診斷分析的指導原則。此外,Lee等[6-8]對生物標志物分析的方法學驗證也進行了全面的總結。

近年來,質譜技術在靈敏度、特異性、研究方法和通量方面的優勢,使其廣泛的應用到生物標志物的研究中。

表2 生物標志物的分析類型及考核內容Table 2 V alidation characteristics of various assay proformance categories of assay

2 阿爾茨海默氏癥中生物標志物的研究進展

過去的25年中,對阿爾茨海默氏癥(Alzheimer’s disease,AD)的基礎以及臨床研究使我們對這種疾病的分子機理和臨床病理有了詳細的認識。阿爾茨海默氏癥是一種復雜的持續性過程,相互影響的病理級聯反應相繼出現,其中包括β-淀粉樣肽(Aβ)的聚集與斑塊發展的相互影響,以及τ蛋白的過磷酸化和聚集與纏結形成的相互作用。連同其他的病理過程,如炎癥和氧化應激,這種病理級聯過程最終導致突觸結構的丟失,以及進行性的神經退行性病變。隨著該領域研究的進展,部分研究結果已經進入候選藥物的研究階段,其中大部分已經進入2期臨床試驗研究,均為緩解疾病癥狀的藥物。從轉基因小鼠模型的研究結果可以看出,這一類緩解疾病的新藥在Aβ聚集過程的早期更加有效,而在嚴重斑塊形成和神經退行性病變的晚期則療效較差。但是,目前用于鑒別阿爾茨海默氏癥患者的診斷標準僅能診斷出神經病理處于晚期的患者,因此需要提升對疾病早期發現的能力。如果能夠早期發現并進行1年的干預癡呆性治療,預計到2050年阿爾茨海默氏癥的患病率會從8 000萬降至900萬。

阿爾茨海默氏癥的生物標志物可以分為兩類:首先是核心生物標志物,它能夠反映疾病的基本發病特征,例如淀粉樣前體蛋白(APP)和Aβ的非正常代謝;其次是下游生物標志物,它能夠反應下游的病理現象,例如軸突變性。目前主要以腦脊液(CSF)為阿爾茨海默氏癥生物標志物的研究對象,腦脊液生物標記物能夠反映大腦神經化學的變化,并且可以通過腰椎穿刺獲得樣本,且無明顯的副作用。相對于腦脊液生物標記物,很少能成功的在外周血液中尋找到生物標志物。事實上,許多已發表的血液生物標志物,在接下來的研究中被證實其診斷價值不高。血漿中的Aβ40和Aβ42雖然可以被測定,但是外周Aβ水平并不能反映大腦中Aβ的變化。

在大量研究中得到確證的腦脊液生物標志物包括:Aβ40,Aβ42,總τ蛋白和磷酸化τ蛋白。其中,Aβ40,Aβ42和磷酸化τ蛋白能作為核心標志物反映阿爾茨海默氏癥疾病過程大腦的淀粉樣病變以及皮質神經纖維纏結;相反,總τ蛋白是反應軸突損傷的非特異性標志物,它能夠反映神經變性的過程。在對阿爾茨海默氏癥不同階段患者的生物標志物研究中,腦脊液中總τ蛋白和磷酸化τ蛋白水平升高,以及 Aβ42或Aβ42/Aβ40降低的綜合評價是較為可靠的生物標志物,這種綜合評價的靈敏度大于95%,特異性大于85%。采用腦脊液生物標志物的綜合診斷已經在3個多中心研究中得以驗證。此外,還有大量的潛在生物標志物能夠反映阿爾茨海默氏癥原發和繼發的病理改變。其中,反映病理進程的標志物包括β位點淀粉樣前體蛋白清除酶1(BACE1)活性和濃度,Aβ降解產物;反映次要事件的標志物包括氧化應激反應和炎癥等,對這些標志物潛在診斷價值的研究相對較少。但是,BACE1活性以及APP異構體對某些候選藥物的生化作用給了重要的信息,例如BACE1抑制劑。

鑒于Aβ在阿爾茨海默氏癥淀粉樣病變級聯學說中的中心地位,定量研究在生物標志物確證中有著重要的意義。Aβ容易自我聚集,或結合于其他蛋白或玻璃表面,使得 ELISA分析變得相對困難。此外,Aβ可能經過翻譯后修飾以及與腦脊液中內源組分產生交叉反應使ELISA分析變得復雜。同樣,LC/MS法也存在挑戰,Aβ的疏水性強,容易吸附在樣本管、進樣器以及色譜柱上,這對質譜分析造成了很大影響。但通過對液相條件進行優化可以改善Aβ聚集的問題,如在反向系統結合堿性洗脫條件下,Aβ的保留行為和回收率可以得到明顯提高[9-10]。

通過選擇特定的質譜分析器以及相應的掃描模式可以提高對Aβ的分析能力。通常,串聯質譜是分析復雜多肽混合物的有效方法,相同質量分析器的串聯質譜包括三重四極桿(QQQ)、3D離子阱(3D ion traps)、線性離子阱(linear ion traps)和串聯飛行時間(TOF-TOFs);結合不同質量分析器的串聯質譜在Aβ的分析中具有更好的能力和表現,其中包括四極桿-時間飛行(Q-TOF)、四極桿-線性離子阱(Q-ion trap)和線性離子阱-傅里葉轉換離子回旋共振(L TQFTICR)。而采用L TQ的全掃描方式是Aβ定量分析的理想選擇。采用這種分析方法,數據處理靈活,且可獲得肽段離子的精確質量數[11-12]。針對Aβ42和Aβ40的特異性可以選擇 Q-L TQ串聯質譜分析系統,掃描模式采用子離子掃描(PI),而非選擇離子掃描(SIM)[10]。在該類研究中,選擇離子掃描無法滿足特異性的要求,因為生物基質中可能存在與Aβ具有相同質荷比的內源性干擾。而通過選擇特定的母子離子對能夠提供更高的特異性。此外,串聯四極桿質譜的多反應監測(MRM)也可以用于多肽的質譜分析,但是,Q-L TQ質譜的增強子離子掃描(EPI)能夠提供更高的靈敏度。另外,由于某些酶的化學修飾作用,Aβ的定量分析可能變得非常復雜,出現無法解釋的Aβ種類[12],導致對Aβ影響的錯誤估計[13]。傳統的MALDI/MS分析使用溶劑會導致對Aβ42中親水部分的過高響應,而兩性部分無質譜響應。隨著MALDI技術的發展,可以不使用溶劑,這樣過高響應和過低響應均會降低,不會給Aβ的測定帶來明顯影響[14]。在沒有標準品的情況下,固相分析是蛋白質分析的有力工具,而MALDI相對于 ESI的優勢是其電離是靜態的,這樣使其能夠輕易地應用到微陣列的分析中。此外,無論化合物相對分子質量的大小,MALDI能夠提供單電荷分子離子,這使得質譜解析變得簡單。

3 結論

隨著質譜技術的發展,其在應用的靈活性、研究通量、準確度和靈敏度都具有獨特的優勢。在生物標志物的研究過程中,對潛在生物標志物的確證是非常重要的,嚴格和認真的生物標志物確證工作是應用質譜進行生物標志物研究的關鍵。同時,只有良好的整合科研與臨床工作,生物標志物的研究才會取得成功。

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Mass Spectrometry in Biomarker Investigation

PENG Ao,ZHAO Qian,J IANGJi,HU Pei
(Clinical Pharmacology Research Center,Peking Union Medical College Hospital,Chinese Academy of Medical Science,Beijing100730,China)

A biomarker is a characteristic,which is objectively measured and evaluated as an indicator of normal biological processes,pathogenic processes or phar macologic responses to a therapeutic agent.They were increasingly used in drug development and clinical diagnostics.There were several platforms and methods used in biomarker investigation,and the mass-based methods had their contribution from the discovery stage to the qualification stage of biomarker investigation.In this review,we discussed the mass-based methods in general biomarker investigation and Alzheimer’s disease.

mass spectrometry;biomarker;Alzheimer’s disease

O 657.63

A

1004-2997(2011)01-0031-05

2010-12-08;

2011-01-17

彭 翱(1979～),男(漢族),湖南人,博士,臨床藥理學專業。E-mail:mailpeng@yahoo.com.cn

胡 蓓(1956～),女(漢族),四川人,教授,博士生導師,臨床藥理學專業。E-mail:pei.hu.pumc@gmail.com