復(fù)元膠囊對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨中胰島素樣生長(zhǎng)因子-I及胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3表達(dá)的影響

牟方政 李榮亨 張文亮 肖彩芝 (重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，重慶 40006)

復(fù)元膠囊對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨中胰島素樣生長(zhǎng)因子-I及胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3表達(dá)的影響

牟方政1李榮亨 張文亮 肖彩芝 (重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，重慶 400016)

目的 觀察復(fù)元膠囊對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨中胰島素樣生長(zhǎng)因子-I(IGF-I)、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3(IGFBP3)表達(dá)的影響。方法 采用右后肢伸直石膏固定法造模，將44只雌雄各半新西蘭大白兔隨機(jī)分為正常組、模型組、鹽酸氨基葡萄糖組、復(fù)元膠囊低、中、高劑量組。正常組4只，其余各組8只。各藥物組每天灌胃1次，持續(xù)6 w。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)IGF-I、IGFBP3表達(dá)。結(jié)果 模型組IGF-I、IGFBP3表達(dá)積分明顯高于正常組(P＜0.01);復(fù)元膠囊各劑量組與模型組比較，IGF-I表達(dá)積分不同程度升高(P＜0.05)，而IGFBP3表達(dá)積分不同程度降低(P＜0.01)，高劑量組顯著。結(jié)論 復(fù)元膠囊具有防治膝骨關(guān)節(jié)炎作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)IGF-I、IGFBP3表達(dá)水平有關(guān)。

骨關(guān)節(jié)炎;胰島素樣生長(zhǎng)因子-I;胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3復(fù)元膠囊

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種中老年人常見(jiàn)的以關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行性退變?yōu)橹鞯墓顷P(guān)節(jié)病。軟骨合成與降解失衡是其退變的主要病理機(jī)制，而細(xì)胞生長(zhǎng)因子和炎癥細(xì)胞因子又是介導(dǎo)軟骨合成與降解失衡的重要生化因素〔1〕。IGF-I作為一種具有促生長(zhǎng)作用的重要調(diào)控因子，能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和基質(zhì)合成〔2〕，這與中醫(yī)“主骨生髓”觀點(diǎn)類似，因此常用補(bǔ)腎法防治骨關(guān)節(jié)炎。復(fù)元膠囊具有補(bǔ)腎活血作用，可通過(guò)降低炎癥因子IL-1β、IL-6表達(dá)，抑制軟骨降解〔3，4〕，但該方在促進(jìn)軟骨合成方面還有待于研究。本實(shí)驗(yàn)建立兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型，觀察軟骨IGF-I、IGFBP3表達(dá)，探討復(fù)元膠囊防治膝骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑 重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的健康新西蘭大白兔44只，雌雄各半，體重(2.5±0.4)kg。合格證:SCXK(渝)20090011。實(shí)驗(yàn)藥物復(fù)元膠囊由鹿茸、淫羊藿、生曬參、黃芪、丹參等組成，重慶希爾安藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，每粒膠囊重0.41 g，相當(dāng)于生藥3 g，僅供實(shí)驗(yàn)使用。對(duì)照藥物鹽酸氨基葡萄糖膠囊(奧泰靈)由香港澳美制藥公司生產(chǎn)(國(guó)藥準(zhǔn)字Z20088501)，規(guī)格為每粒含鹽酸氨基葡萄750 mg。IGF-I抗兔多克隆抗體、IGFBP3抗兔多克隆抗體、SP免疫組化檢測(cè)試劑盒、DAB顯色試劑盒由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 分組 將44只新西蘭大白兔隨機(jī)分為正常組、模型組、鹽酸氨基葡萄糖組、復(fù)元膠囊低、中、高劑量組。正常組4只，其余各組8只，每只均單籠飼養(yǎng)。

1.2.2 造模 所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物同等條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，除正常組外，其余各組采用右后肢膝關(guān)節(jié)伸直石膏固定法造模〔5〕:實(shí)驗(yàn)兔放入固定器，先剪去右后肢踝關(guān)節(jié)以上的兔毛，用醫(yī)用紗布裹上兩層，再用管型石膏將其伸直位固定，石膏外以透明膠紙封好，若石膏松動(dòng)或脫落者及時(shí)重新固定，持續(xù)6 w，造成膝骨關(guān)節(jié)炎模型。

1.2.3 給藥 根據(jù)Meeh-Rubner公式，按成人(60 kg)體表面積與家兔體表面積換算等效劑量，復(fù)元膠囊中劑量組給予等效劑量2 700 mg·kg－1·d－1，復(fù)元膠囊低劑量組 1 350 mg·kg－1·d－1，復(fù)元膠囊高劑量組5 400 mg·kg－1·d－1，鹽酸氨基葡萄糖組90 mg·kg－1·d－1。造模后1 w開(kāi)始給藥，除正常組和模型組外，各組藥物飲用水溶解后灌胃，1次/d，持續(xù)6 w。

1.2.4 取材 用藥6 w后，處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，切取股骨內(nèi)側(cè)髁完整軟骨及軟骨下骨組織標(biāo)本，其中正常組取雙后肢軟骨做標(biāo)本，用4%多聚甲醛溶液固定20 h，15%EDTA脫鈣3～5 w，磷酸鹽緩沖液充分沖洗，石蠟縱向包埋固定，常規(guī)切片。

1.2.5 主要觀察指標(biāo) 按照免疫組織化學(xué)染色法(SP法)操作說(shuō)明檢測(cè)IGF-I、IGFBP3表達(dá)。每張切片選取6個(gè)高倍視野(400倍)，其中三個(gè)視野包括表中層、三個(gè)視野包括中深層，由兩個(gè)不同觀察者完成。細(xì)胞染色為黃色或棕色為陽(yáng)性細(xì)胞，參考Pelletier等〔6〕方法計(jì)算每個(gè)高倍視野下的陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞總數(shù)。IGF-I、IGFBP3陽(yáng)性軟骨細(xì)胞用細(xì)胞分?jǐn)?shù)表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以±s表示，采用單因素方差分析，兩組間比較用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 IGF-I、IGFBP3表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn) 正常組軟骨僅在表層和中上層見(jiàn)到少許陽(yáng)性細(xì)胞;模型組軟骨細(xì)胞可見(jiàn)不同程度著色，軟骨細(xì)胞的胞漿及胞核可見(jiàn)黃色及棕色著色，IGF-I以核染色為主，IGFBP3以胞漿染色為主，軟骨各層均可見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞，但以中層更為顯著;模型組與鹽酸氨基葡萄糖組無(wú)明顯差異;復(fù)元膠囊各劑量組IGF-I表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞增多，著色棕黃為主，IGFBP3表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞相對(duì)減少，著色淡黃為主。見(jiàn)圖1。達(dá)積分升高，IGFBP3表達(dá)積分降低(P＜0.05，P＜0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠軟骨中IGF-I、IGFBP3表達(dá)(±s)

表1 各組大鼠軟骨中IGF-I、IGFBP3表達(dá)(±s)

與正常組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.05，3)P＜0.01;與鹽酸氨基葡萄糖組比較:4)P＜0.05，5)P＜0.01

組別 n 4 1.68±0.16 1.88±0.23模型組 8 4.15±0.541) 5.52±0.581)鹽酸氨基葡萄糖組 8 4.20±0.31 5.46±0.34復(fù)元膠囊低劑量組 8 4.54±0.422) 5.23±0.323)復(fù)元膠囊中劑量組 8 4.78±0.682)4) 4.68±0.463)5)復(fù)元膠囊高劑量組 8 5.02±0.742)4) 3.35±0.283)5)IGF-I IGFBP3正常組

圖1 各組IGF-I，IGFBP3陽(yáng)性細(xì)胞學(xué)形態(tài)(DAB，×400)

2.2 IGF-I、IGFBP3表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞形態(tài)學(xué)計(jì)量 模型組IGF-I、IGFBP3表達(dá)積分與正常組比較均升高(P＜0.01)。復(fù)元膠囊各組與模型組比較，IGF-I表達(dá)積分不同程度升高，而IGFBP3表達(dá)積分則不同程度降低(P＜0.05，P＜0.01)，高劑量組顯著。復(fù)元膠囊中高劑量組與鹽酸氨基葡萄糖組比較，IGF-I表

3 討論

IGF-I是人體內(nèi)一種與胰島素結(jié)構(gòu)相似的重要生長(zhǎng)因子，主要由肝臟、骨及軟骨組織細(xì)胞合成，通過(guò)內(nèi)分泌、旁分泌或自分泌方式作用于靶器官，與組織細(xì)胞表面IGF-I受體結(jié)合后，激活PI3K和MAPK信號(hào)通路發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)，可以促進(jìn)細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞遷移，抑制細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育，機(jī)體代謝，抗衰老等過(guò)程，對(duì)機(jī)體多個(gè)系統(tǒng)的損傷及修復(fù)具有十分重要的作用。在軟骨中IGF-I通過(guò)促進(jìn)軟骨細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)多糖和膠原蛋白，抑制軟骨細(xì)胞凋亡〔2〕，維持軟骨合成與降解平衡，但I(xiàn)GF-I這一生理效應(yīng)受胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(IGFBPs)調(diào)控，IGFBPs與IGF-I結(jié)合可以降低IGF-I與其受體之間的親和力，從而抑制了IGF-I的生物活性〔7〕。

OA以軟骨退行性改變?yōu)橹饕憩F(xiàn)，勢(shì)必存在軟骨細(xì)胞分泌IGF-I不足，但事實(shí)上則相反，國(guó)外研究證實(shí)在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中IGF-ImRNA表達(dá)增加，比正常高3.5倍，IGFBP3表達(dá)也增加，且比正常高24倍〔8〕。軟骨細(xì)胞合成IGF-I增加，理應(yīng)能夠促進(jìn)軟骨合成而發(fā)揮自我修復(fù)，但是軟骨病理形態(tài)改變并沒(méi)有因此減輕，這可能與IGFBP3表達(dá)增加更多有關(guān)。IGFBP3表達(dá)增加，與IGF-I結(jié)合增多，抑制IGF-I與其受體結(jié)合，從而IGF-I促軟骨合成效能降低，導(dǎo)致軟骨退變。

OA相當(dāng)于中醫(yī)“骨痿”“骨痹”范疇。中醫(yī)認(rèn)為本病多因年邁肝腎虧虛，氣血不足，風(fēng)寒濕邪侵入骨骼，以致血瘀阻經(jīng)絡(luò)所致。腎藏精，主骨生髓;腎精足則骨髓充，骨骼得以滋養(yǎng)，筋骨堅(jiān)強(qiáng)。本病主要病機(jī)特點(diǎn)為本虛標(biāo)實(shí)，本痿標(biāo)痹，以腎精不足，筋骨失養(yǎng)為本，以痰濕血瘀，痹阻筋絡(luò)關(guān)節(jié)為標(biāo)。復(fù)元膠囊從臨床上治療骨關(guān)節(jié)炎行之有效的復(fù)元湯化裁而來(lái)，由鹿茸、淫羊藿、丹參、生曬參、黃芪等中藥配伍而成，具有補(bǔ)腎活血益氣之效。前期研究提示該藥可以通過(guò)降低骨關(guān)節(jié)炎軟骨中IL-1表達(dá)，增強(qiáng)TGF-β2表達(dá)，調(diào)節(jié)MMPs/TIMPs平衡起到防治骨關(guān)節(jié)炎的作用〔3〕。現(xiàn)代研究表明鹿茸提取物和淫羊藿提取物能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖、基質(zhì)合成和抑制軟骨細(xì)胞凋亡〔9，10〕;人參提取物可以促進(jìn)缺血損傷腦組織IGF-I表達(dá)〔11〕;黃芪、丹參可促進(jìn)MAPKs通路中ERK蛋白磷酸化水平的表達(dá)修復(fù)骨骼肌損傷，其作用與IGF-I類似〔12〕。本實(shí)驗(yàn)提示復(fù)元膠囊可能是通過(guò)調(diào)節(jié)IGF-I、IGFBP3表達(dá)水平，促進(jìn)軟骨修復(fù)，起到防治膝骨關(guān)節(jié)炎的作用。

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Effect of FuYuan capsule on expression of IGF-I and IGFBP3 in cartilage of knee osteoarthritis rabbit

MOU Fang-Zheng，LIRong-Heng，ZHANG Wen-Liang，et al.
Department of Traditional Medicine Integrated W estern Medicine，the First Affiliated Hospital，Chongqing M edical University，Chongqing 400016，China

Objective To observe the influence of FuYuan capsule on IGF-Ⅰ and IGFBP3 in cartilage of rabbitwith knee osteoarthritis.Methods 44 healthy New Zealand big rabbits composed ofmale and female in equal were randomly divided into normal，model，glucosamine hydrochloride and different dose FuYuan capsule groups，4 in normal group and 8 in other groups.The right hind limbs of all model rabbitswere fixed by plaster bandage in the straight situation.Drug groups were respectively fed with glucosamine hydrochloride and different doses of FuYuan capsule one times daily for6 weeks.The levels of IGF-Ⅰand IGFBP3 in cartilage were detected through immunohistochemistry.The positive cells fraction and tinctorial strength were used by scoring method tomeasure the levels of IGF-I and IGFBP3.Results Total score of IGF-Iand IGFBP3 expressions in model group were higher than those of normal group(P＜0.01).Compared with FuYuan capsule groups，especially high-dose and model groups，the total score of IGFBP3 level was decreased significantly(P ＜0.01)，while the total score of IGF-Ⅰ levelwas increased(P ＜0.05).Conclusions FuYuan capsule can play an important role in prevention and treatment of osteoarthritis，which could be concerned to regulating the levels of IGF-Iand IGFBP3 in cartilage.

Osteoarthritis;Insulin-like growth factor I(IGF-I);Insulin-like growth factor bindingprotein3(IGFBP3);Fu Yuan capsule

R684

A

1005-9202(2011)12-2229-03

重慶市衛(wèi)生局資助課題(No.〔2004〕12-B-55)

1 重慶市三峽中心醫(yī)院中醫(yī)科

李榮亨(1945-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合風(fēng)濕病、腎病、老年病的防治研究。

牟方政(1981-)，男，在讀碩士，主要從事中西醫(yī)結(jié)合對(duì)老年病防治的研究。

book=1,ebook=794

〔2010-11-23收稿 2011-01-20修回〕

(編輯 曲 萌/曹夢(mèng)園)