電刺激大鼠上矢狀竇旁硬腦膜后血漿降鈣素基因相關(guān)肽和P物質(zhì)的變化

董釗,姜磊,于生元

電刺激大鼠上矢狀竇旁硬腦膜后血漿降鈣素基因相關(guān)肽和P物質(zhì)的變化

董釗,姜磊,于生元

目的觀察電刺激上矢狀竇旁硬腦膜對(duì)大鼠血漿降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)和P物質(zhì)濃度的影響。方法13只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(n=6)和電刺激組(n=7)。對(duì)照組行假刺激,電刺激組以20 Hz、4 mA和250 μ s的方波電流刺激上矢狀竇旁硬腦膜,使用放射免疫法比較血漿CGRP和P物質(zhì)的濃度。結(jié)果對(duì)照組與電刺激組的血漿CGRP濃度相比有顯著性差異(50.60±7.16 pg/ml vs 42.20±4.82 pg/ml,P=0.029),而血漿P物質(zhì)濃度相比無(wú)顯著性差異(308.59±43.07 pg/ml vs 264.60±60.28 pg/ml,P=0.165)。結(jié)論電刺激上矢狀竇旁硬腦膜能夠降低大鼠血漿CGRP濃度,而P物質(zhì)濃度無(wú)明顯變化。

電刺激;上矢狀竇;降鈣素基因相關(guān)肽;P物質(zhì);大鼠

降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)和P物質(zhì)(substance P,SP)是在人類偏頭痛發(fā)病機(jī)制中起著重要作用的兩種肽類物質(zhì)。我們?cè)谇捌谘芯恐欣秒姶碳ご笫笊鲜笭罡](sinus sagittalis superior,SSS)旁硬腦膜的方法建立了一種新的偏頭痛動(dòng)物模型[1],并從行為學(xué)、微循環(huán)和組織學(xué)證實(shí)此模型的可行性[1-4]。本實(shí)驗(yàn)將利用此方法研究大鼠血漿中CGRP和SP的變化,從神經(jīng)遞質(zhì)水平進(jìn)一步闡明偏頭痛的發(fā)病機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠13只,由解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,體重280～320 g,平均(300±20)g,隨機(jī)分為手術(shù)對(duì)照組(n=6)和電刺激組(n=7)。

1.2 主要試劑與儀器 10%EDTA、抑肽酶、CGRP放免試劑盒均由解放軍總醫(yī)院東亞放免研究所提供。電刺激器(型號(hào):SEN-7103):日本光電工業(yè)株式會(huì)社;分離器(型號(hào):SS-102J):日本光電工業(yè)株式會(huì)社;臺(tái)式牙鉆床(型號(hào):307-6):上海齒科器械廠;金屬電極:北京東恒宇技術(shù)開發(fā)中心;冷凍離心機(jī)(型號(hào):DDL-5):上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物模型制備 大鼠用10%水合氯醛0.4 ml/100 g腹腔麻醉成功后,頭正中部剪掉毛發(fā),固定于立體定位儀上,消毒皮膚,逐層切開皮膚、肌肉,分離骨膜后徹底暴露顱骨,以顱中線冠狀縫交叉點(diǎn)前4 mm為前界,交叉點(diǎn)后6 mm為后界,用臺(tái)式牙科鉆鉆開兩個(gè)直徑約1 mm的圓孔,鉆孔時(shí)間斷使用4℃生理鹽水以降低鉆頭及孔的溫度,以防灼傷硬膜,在剝離顱骨骨片時(shí)需注意勿劃破硬膜及SSS。以上所有操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行,整個(gè)操作過程保持輕柔、安靜,避免強(qiáng)光,室溫保持25℃左右。

1.3.2 電刺激方法 將金屬電極一前一后放置于刺激孔之上硬腦膜,應(yīng)用刺激器和分離器行電刺激5 min,刺激參數(shù)為:頻率 20 Hz 、脈寬 250 μ s、強(qiáng)度 4 mA。

1.3.3放射免疫法測(cè)定血漿CGRP和SP含量 將大鼠于刺激結(jié)束后馬上開胸并暴露心臟,以10 ml注射器從心尖部位抽取全血4 ml,去掉針頭,緩慢注入含有10%EDTA 60 μ l和抑肽酶 80 μ l的無(wú)菌離心管中 ,輕輕混勻后立即4℃3000 r/min離心20 min,在整個(gè)處理過程中防止溶血,吸上清液分裝于兩個(gè)EP管中,加蓋存-80℃冰箱待測(cè)。集中測(cè)定前,使樣本置于冷水復(fù)融,再次 4 ℃3000 r/min離心 5 min,取上清液,按放免試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 血漿CGRP濃度 對(duì)照組和電刺激組分別為(50.60±7.16)pg/ml和(42.20±4.82)pg/ml,兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.029)。見圖1。

2.2 血漿SP濃度 對(duì)照組和電刺激組分別為(308.59±43.07)pg/ml和(264.60±60.28)pg/ml,兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.165)。見圖2。

圖1 對(duì)照組和電刺激組的血漿CGRP比較

圖2 對(duì)照組和電刺激組的血漿SP比較

3 討論

CGRP是一種由37個(gè)氨基酸組成的生物活性多肽,在神經(jīng)系統(tǒng)中以脊髓含量最高,特別是背側(cè)角、背根神經(jīng)節(jié)及三叉神經(jīng)節(jié)。CGRP發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)可能的途徑為其可與平滑肌受體結(jié)合,激活腺苷酸環(huán)化酶,使細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度升高,進(jìn)而作為第二信使促進(jìn)Ca2+從胞漿攝入至細(xì)胞內(nèi)的膜結(jié)構(gòu)中,阻斷Ca2+向細(xì)胞內(nèi)流動(dòng),引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度下降,最終導(dǎo)致鈣調(diào)蛋白形成肌球蛋白輕鏈激酶,使肌動(dòng)球蛋白的ATP酶激活發(fā)生障礙,產(chǎn)生擴(kuò)血管效應(yīng)。另一方面,通過cAMP依賴的蛋白激酶作用,使肌球蛋白的輕鏈激酶失活,引起擴(kuò)血管效應(yīng)。它是迄今已知最強(qiáng)大的血管舒張肽,在疼痛感覺和調(diào)控中也有重要作用[5-6]。

偏頭痛發(fā)病機(jī)制中的神經(jīng)源性炎癥假說認(rèn)為,偏頭痛中肽類物質(zhì)的釋放導(dǎo)致以血管擴(kuò)張、血漿蛋白滲出、肥大細(xì)胞脫顆粒等為特征的神經(jīng)源性炎癥。而此過程中與三叉神經(jīng)血管反射系統(tǒng)最相關(guān)的神經(jīng)肽是CGRP[7]。SP是另一種和三叉神經(jīng)血管反射激活有關(guān)的肽類物質(zhì),和神經(jīng)激肽A、神經(jīng)激肽B等同屬于速激肽類,是初級(jí)傳入纖維末梢釋放的神經(jīng)遞質(zhì),在脊髓主要位于背側(cè)角,在腦干主要位于導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)、中縫大核、網(wǎng)狀巨核細(xì)胞等,對(duì)傷害性痛覺的傳遞起著重要作用[8]。

目前關(guān)于不同的動(dòng)物模型及偏頭痛患者血漿中CGRP和SP的變化的研究結(jié)果尚不完全一致。有研究發(fā)現(xiàn)電刺激離體的鼠硬腦膜的5 min刺激期間,CGRP釋放增加,在刺激后采樣期間恢復(fù)至基線水平,而SP卻無(wú)明顯變化[9]。還有研究發(fā)現(xiàn),刺激動(dòng)物SSS可以導(dǎo)致頸靜脈血中CGRP和血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)的升高,而SP和神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y,NPY)無(wú)明顯改變[10]。關(guān)于偏頭痛患者,多數(shù)報(bào)道認(rèn)為患者頭痛發(fā)作間歇期CGRP反應(yīng)升高,而SP無(wú)明顯變化[11-13]。但也有研究發(fā)現(xiàn),在偏頭痛的頭痛緩解后4 d內(nèi)的周圍血樣中CGRP與SP是降低的,而且在頭痛剛緩解,尚存頭部不適患者的CGRP降低更為明顯[14]。但同樣的研究者在刺激大鼠三叉神經(jīng)節(jié)5 min后發(fā)現(xiàn)CGRP和SP的水平均明顯升高[15]。

本研究發(fā)現(xiàn),電刺激組較對(duì)照組的CGRP血漿水平有所降低,而SP無(wú)明顯變化。采血樣的時(shí)機(jī)是影響測(cè)定結(jié)果的重要因素。當(dāng)頭痛發(fā)作初始或者刺激正在進(jìn)行時(shí),這些肽類在神經(jīng)末梢大量釋放,這時(shí)血中濃度可升高;在頭痛緩解期的某一時(shí)程,這些肽類經(jīng)代謝而降低,而神經(jīng)末梢處于排空狀態(tài)時(shí),血中CGRP濃度無(wú)法得到適時(shí)補(bǔ)充而漸消失。本研究結(jié)果提示,CGRP在偏頭痛的發(fā)病過程中可能有較大的波動(dòng),從另一角度支持在頭痛期感覺神經(jīng)末梢釋放CGRP的觀點(diǎn)[16]。在后續(xù)研究中我們將進(jìn)一步研究在不同時(shí)間點(diǎn)這些神經(jīng)肽類的動(dòng)態(tài)變化,以進(jìn)一步闡明偏頭痛等血管源性頭痛的發(fā)病機(jī)制。

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Changes of PlasmaConcentration of Calcitonin Gene-related Peptide and Substance P after Electrical Stimulation on Dura Mater Adjacent to Sinus Sagittalis Superior in Rats

DONG Zhao,J IANG Lei,YU Sheng-yuan.Departmentof Neurology,Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853,China

ObjectiveTo analyze the changes of plasma concentration of calcitonin gene-related peptide(CGRP)and substance P(SP)after electrical stimulation on dura mater adjacent to sinus sagittalis superior(SSS)in rats.Methods13 rats were randomly divided into control group(n=6)and stimulation group(n=7)in which the dura matter adjacent to SSS was stimulated electrically with square wave of 20 Hz,4 mA and 250μ s.The plasma concentrations of CGRP and SP in both groups were compared by means of radioimmunity method.ResultsThere was significant difference in the plasma concentration of CGRP between control and stimulation groups(50.60±7.16 pg/ml vs 42.20±4.82 pg/ml,P=0.029).However,there was no significant difference in the plasma concentration of SP between two groups(308.59±43.07 pg/ml vs 264.60±60.28 pg/ml,P=0.165).ConclusionPlasma concentration of CGRP decreased after electrical stimulation on dura mater in rats but the concentrations of SP unchanged.

electrical stimulation;superior sagittal sinus;calcitonin gene related peptide;substance P;rats

[本文著錄格式]董釗,姜磊,于生元.電刺激大鼠上矢狀竇旁硬腦膜后血漿降鈣素基因相關(guān)肽和P物質(zhì)的變化[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2011,17(4):334—336.

解放軍總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,北京市 100853。作者簡(jiǎn)介:董釗(1976-),男,河南洛陽(yáng)市人,博士,主治醫(yī)師,主要研究方向:頭面痛的基礎(chǔ)與臨床研究。通訊作者:于生元。

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R245,R338

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1006-9771(2011)04-0334-03

2011-02-22)

·基礎(chǔ)研究·