針康法對免疫抑制大鼠細胞免疫功能的影響

朱志中,唐強,顏培宇

針康法對免疫抑制大鼠細胞免疫功能的影響

朱志中1,唐強2,3,顏培宇3

目的觀察針康法對免疫抑制大鼠模型血清白細胞介素-4(IL-4)及T細胞亞群的影響。方法將40只健康SD大鼠(雄性)體重200～250 g,完全隨機分為5組:正常組、模型組、康復組、針康組、針刺組,每組8只。除正常組和模型組外,其他各組分別給予針刺或康復治療,每天1次,治療10 d后,取大鼠血清。用放射免疫法檢測血清中IL-4含量及外周血CD4+T細胞和CD8+T細胞的含量。結果模型組血清IL-4水平升高,與正常組比較有顯著性差異(P＜0.05)。康復治療和針康法都可降低免疫抑制大鼠血清IL-4水平,與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05);模型組大鼠CD4+T細胞水平下降,與正常組比較有顯著性差異(P＜0.05);經針刺和康復治療后,針刺組和針康組大鼠外周血CD4+T細胞水平明顯升高,與模型組比較有非常顯著性差異(P＜0.01)。實驗各組CD8+T細胞水平于治療前后無顯著性差異(P＞0.05)。結論針康法能降低大鼠血清中IL-4的含量,顯著提高免疫抑制大鼠低下的CD4+T細胞水平,提高機體的細胞免疫功能。

免疫抑制;針康法;白細胞介素-4;T細胞亞群;大鼠

免疫抑制現象存在于多種疾病狀態中,如病毒感染、惡性腫瘤、不孕不育、腦血管病及艾滋病等。多表現為免疫功能低下、應答性淋巴細胞的數量減少、免疫抑制性因子活性增強。本實驗以免疫抑制大鼠為模型,探討針康法干預后免疫抑制大鼠免疫功能變化,為針康法臨床治療提供科學依據。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級健康SD大鼠(雄性)40只,體重200～250 g,由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供(許可證號SCXK(京)2007-0001)。

1.2 模型制作及分組 取鼠后,飼養環境控制室溫(22±1)℃,12 h光暗交替(7:00～19:00照明)。進入實驗室最初4 d為適應環境期,自由進食和飲水,并每天撫摸2～3 min,以適應實驗人員操作。實驗第5天,各組均腹腔注射新鮮配制的環磷酰胺注射液50 mg/kg,連續3 d,第4天加強注射1次,制成免疫抑制模型。采用數字隨機法將40只大鼠隨機分為5組:正常組、模型組、康復組、針康組、針刺組,每組8只。

1.3 干預方法

1.3.1 康復訓練 ①滾筒訓練:滾筒長100 cm,直徑60 cm,中間被分為4個格,可同時訓練4只鼠。底座有固定架,一端有手搖柄,可手搖控制轉動速度,常規為10 r/min。將大鼠放入該器內可訓練大鼠的抓握、旋轉、行走等運動,每天1次,每次20 min。②網屏訓練:網屏為50×40 cm金屬網帶,網眼為1×1 cm,網板的左右和上方都用25 cm高的木板框邊,網屏距地而高度為80 cm,下方鋪以12 cm厚的海綿。先將網屏水平放置,將老鼠放在其上,然后將其一端抬高,在2 s內將此屏變成垂直位,保持5 s訓練大鼠的肢體抓握能力,每天1次,每次 20 min。

1.3.2 針刺

1.3.2.1 選穴及定位 選穴:百會及百會旁開0.5 cm相當于于氏頭針的頂區,足三里、關元(注:針刺組和針康組均選用以上各穴)。取穴定位:參照“十一五”國家規劃統編教材《實驗針灸學》和《腧穴學》大鼠標準穴位圖,定位及擬人對照法定位。膝關節后外側腓骨小頭下3.5 mm處定位足三里;在劍突和外生殖器連線的上6/7與下1/7交界處定位關元穴;大鼠頭背部正中縱線與兩耳連線的交點上準確定位百會穴。

1.3.2.2 針刺方法及針具 大鼠清醒固定,各穴進針3～10 mm,留針30 min。每天 1次,治療 10 d。針具選擇華佗牌30號1寸針灸針。

正常組、模型組不采用任何干預措施,康復組采用康復訓練,針刺組采用針刺治療,針康組先采用針刺治療,然后進行康復訓練。

1.4 標本采集 ①按0.35 ml/100 g大鼠腹腔注射10%水合氯醛,麻醉后用負壓采血管心臟取血5 ml左右;②采血后將采血管放入4℃冰箱靜置6 h,取出后3000 r/min,離心20 min;③取盡量多每管中的上清液,放入小試管中。

1.5 指標檢測及方法 血清白細胞介素-4(IL-4)的測定采用酶標試劑盒(酶聯免疫吸附法ELISA);大鼠外周血中CD4+T細胞和CD8+T細胞的含量的測定采用酶標試劑盒(酶聯免疫吸附法ELISA)。

每個標準品和空白孔做復孔。加入稀釋好后的標準品 50 μ l于反映孔內、加入待測樣品血清 50 μ l于反映孔內。立即加入50 μ l的生物素標記的抗體。蓋上膜板,輕輕振蕩混勻,37℃溫育45 min。甩去孔內液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30 s,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復此操作4次。每空加入100 μ l的親和鏈霉素-HRP,輕輕震蕩混勻,37℃溫育30 min。甩去孔內液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30 s,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復此操作4次。每孔加入底物A、B各50 μ l,輕輕震蕩混勻,37℃溫育5 min。避免光照。取出酶標板,迅速加入50μ l終止液,立即在450 nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)。

1.6 統計方法 采用SPSS 13.0統計軟件進行統計學處理。不同組間比較采用單因素方差分析(Oneway ANOVA),方差齊時選擇 LSD法,方差不齊時選擇Dunnett T3法。

2 結果

2.1 不同干預方法對血清IL-4含量的影響 與模型組比較,針刺組無顯著性差異(P＞0.05);與模型組比較,康復組和針康組有顯著性差異(P＜0.05);康復組與針康組之間無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清IL-4含量的比較(pg/ml)

2.2 不同干預方法對CD4+T細胞和CD8+T細胞的影響 與正常組比較,模型組大鼠CD4+T細胞水平及CD8+T細胞水平明顯下降(P＜0.01);經針刺和康復治療后,針刺組和針康組CD4+T細胞數量明顯升高(P＜0.01),與模型組比較有非常顯著性差異(P＜0.01)。實驗各組CD8+T細胞水平于治療前后無明顯變化(P＞0.05)。見表2。

表2 大鼠CD4+T細胞和CD8+T細胞的含量(%)

3 討論

3.1 實驗模型的選擇 目前常用免疫抑制劑制備免疫抑制模型。環磷酰胺是治療惡性腫瘤最常用的烷化劑代表藥物,具有廣譜抗癌作用,是聯合化療、手術和放療輔助化療的常用藥物之一,毒副作用主要是免疫抑制。利用環磷酰胺制備免疫抑制模型相對成熟,模型穩定。研究表明,環磷酰胺制備的免疫抑制模型可以降低實驗動物的脾臟指數、抑制淋巴細胞增殖,降低自然殺傷細胞活性、抗體生成細胞功能等。本實驗選擇相對成熟穩定創傷小的造模方法,觀察針康法對免疫功能的影響。在劑量選擇上,有報道用大劑量100 mg/kg或200 mg/kg[1-3]一次性注射制備模型,也有用小劑量多次注射的方法,劑量為20～80 mg/kg不等,注射天數2～5 d不等[4-9]。預試驗發現,50 mg/kg注射量安全可靠,天數在4 d為宜,造模后實驗大鼠出現食欲減退,毛色粗糙,部分大鼠出現血尿及乳糜尿。

3.2針康法對免疫抑制大鼠血清IL-4含量的影響IL-4曾被命名為B細胞生長因子-1。IL-4主要由活化的CD4+T細胞、肥大細胞和NK細胞產生,主要作用于B細胞,促進其分化和增殖,表達主要組織相容性復合體Ⅱ類分子(MHC-Ⅱ),增強B細胞的抗原提呈作用,誘導IgE的產生。IL-4還作用于單核/巨噬細胞,抑制其產生IL-1、IL-6和腫瘤壞死因子;協同IL-3刺激肥大細胞增殖和協同腦脊液刺激造血細胞增殖[10]。

本實驗結果顯示,模型組血清IL-4水平升高,與正常組比較有顯著性差異(P＜0.05)。康復組和針康組都降低免疫抑制大鼠血清IL-4水平(P＜0.05)。

3.3 針刺結合康復訓練對免疫抑制大鼠CD4+T細胞和CD8+T細胞的影響 CD4+T細胞是不均一的細胞群,根據所分泌細胞因子的不同將CD4+T細胞分為Th1和Th2細胞。目前已分別在小鼠和人類建立Th1和Th2細胞克隆。Thl細胞主要介導與細胞毒和局部炎癥有關的免疫應答,參與細胞免疫及遲發型超敏反應性炎癥的形成,故也稱之為炎性T細胞,可認為相當于遲發型超敏反應T細胞(TDTH細胞)。因而Th1細胞在抗細胞內病原體(包括病毒、細菌及寄生蟲等)感染中發揮重要作用。Th2細胞的主要功能是刺激B細胞增殖并產生抗體,與體液免疫相關。CD8+T細胞又稱細胞毒性 T細胞(CT L),參與抗病毒免疫、抗腫瘤免疫以及對移植物的排斥反應。CT L的主要殺傷機制為:①分泌穿孔素和顆粒酶,引起細胞溶解;②活化的CTL表達FasL,通過與靶細胞表面的Fas抗原結合,誘導靶細胞凋亡。

T細胞亞群的數量及活性是細胞免疫功能的直接反映。實驗中模型組大鼠與正常組比較CD4+T細胞水平明顯下降,提示造模后大鼠的細胞免疫功能受到抑制;與模型組比較,經針刺和康復治療后,針刺組和針康組CD4+T細胞數量明顯升高(P＜0.01)。說明針刺和康復訓練能夠顯著提高免疫抑制大鼠的細胞免疫功能,具有增強免疫的作用。

本研究結果表明,單純康復訓練可以降低模型組大鼠血清IL-4的含量,單純針刺治療亦可提高模型組大鼠CD4+T細胞數量,而針康法的優勢在于在降低模型組大鼠血清IL-4的含量同時亦可提高模型組大鼠CD4+T細胞數量而取得較好的治療效果。

[1]羅秋平,譚禮智,王慧.卡介菌多糖核酸和死卡介菌對環磷酰胺免疫抑制作用的影響[J].湖南醫科大學學報,1996,21(4):281-284.

[2]雷志明,于芳,鄒梅,等.環磷酰胺對小鼠免疫功能的影響[J].衛生毒理學雜志,1989,3(2):108-109.

[3]馮景奇,柳鐘勛.當歸內酯拮抗環孢菌素A、氫化可的松及抗腫瘤藥物的免疫抑制作用[J].中國免疫學雜志,2000,(1):22-24.

[4]代卉,樂國偉,孫進,等.小麥肽對受環磷酰胺免疫抑制小鼠的免疫調節及抗氧化功能[J].生物工程學報,2009,(4):549-553.

[5]高芃,錢嘉林,劉長喜,等.環磷酰胺對小鼠免疫抑制的動物模型建立[J].環境與職業醫學,2004,(4):314-317.

[6]呂建新,金麗琴.細腳擬青霉對小鼠體液免疫功能的影響[J].中國實驗臨床免疫學雜志,1996,8(6):8-10.

[7]郭國華,魯耀邦,蔣茂恒,等.人參五靈脂水煎液配伍對免疫低下小鼠免疫功能的影響[J].中草藥,1994,25(5):253-255.

[8]關寧,霍桂枝,於傳斌,等.金藍寶對小鼠免疫功能的影響[J].中國海洋藥物雜志,1996,2:7-11.

[9]韓春楊,劉翠艷.中藥免疫調節劑對免疫抑制模型小鼠的保護作用[J].J Northwest A F University(Natural Science E-dition),2010,38(2):47-51.

[10]唐恩潔.醫學免疫學[M].成都:四川大學出版社,2004.

Effect of Cluster Needling of Scalp Acupuncture Combined with Rehabilitation on Cellular Immunity of Immunosuppressive Rats

Z HU Zhi-zhong,TANGQiang,Y AN Pei-yu.Tianjin Huanhu Hospital,Tianjin 300060,China

ObjectiveTo observe the effect of cluster needling of scalp acupuncture combined with rehabilitation(Tang's Approach)on interleukin-4(IL-4),T lymphocyte subsets of immunosuppressive model rat.Methods40 healthy SD rats(male,200～250 g)was divided into 5 groups randomly:normal group(NG),model group(MG),acupuncture group(AG),rehabilitation group(RG),and acupuncture with rehabilitation group(ARG),8 rats in each group.Each group was treated by acupuncture or rehabilitation except the model or normal group,once a day for 10 d.Radioimmunoassay and malondialdehydein(MDA)technique were used to test the contents of IL-4 and T lymphocyte subsets in each group.ResultsThe contents of IL-4 of immunosuppressive rats can decrease significantly in RG and ARG(P＜0.05).The level of CD4+T lymphocyte increased more significantly in AG and RAG than in MG after the treatment(P＜0.01).ConclusionTang's Approach can decrease the contents of IL-4 and improve the level of CD4+T lymphocyte in rats.

immunosuppression;Tang's Approach;interleukin-4;T lymphocyte subsets;rat

[本文著錄格式]朱志中,唐強,顏培宇.針康法對免疫抑制大鼠細胞免疫功能的影響[J].中國康復理論與實踐,2011,17(4):313—315.

1.教育部高等學校博士點專項科研基金(20092327110002);2.黑龍江省研究生創新科研資金項目(YJSCX2009-163HLJ)。

1.天津市環湖醫院康復醫學科,天津市 300060;2.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院,黑龍江哈爾濱市150001;3.黑龍江中醫藥大學,黑龍江哈爾濱市 150004。作者簡介:朱志中(1983-),男,黑龍江雙鴨山市人,碩士研究生,醫師,主要研究方向:神經疾病的綜合康復治療。通訊作者:唐強(1963-),男,教授,博士生導師,主要從事神經系統疾病中醫康復方法研究。

R245,R49

A

1006-9771(2011)04-0313-03

2011-03-16)

·專題·