固本補(bǔ)腎湯對(duì)前列腺基質(zhì)細(xì)胞增殖的影響

朱 閩，覃兆偉，荀建寧，梁永協(xié)，周 凱

廣西中醫(yī)學(xué)院附屬瑞康醫(yī)院男性科，廣西南寧 530011

良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）多見(jiàn)于老年人，發(fā)病率隨著年齡的增加而呈上升趨勢(shì)[1]。迄今為止BPH的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，但總是細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡共同作用的結(jié)果。筆者為探討固本補(bǔ)腎湯治療BPH的作用機(jī)制，進(jìn)行了體外人前列腺基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)，用四氮唑藍(lán)法（MTT）檢測(cè)藥物對(duì)體外培養(yǎng)人前列腺基質(zhì)細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 標(biāo)本來(lái)源 本次研究細(xì)胞培養(yǎng)用的前列腺組織塊取自經(jīng)恥骨上前列腺摘除術(shù)切除的前列腺標(biāo)本，每分標(biāo)本重量2～3 g，經(jīng)組織學(xué)證實(shí)為BPH組織。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 1640培養(yǎng)液（美國(guó)Glbco公司），DMEM培養(yǎng)液（美國(guó)Glbco公司），胎牛血清（美國(guó)Gibco公司），馬血清（美國(guó) Gibco公司），MTT（美國(guó) Sigma公司），二甲基亞砜（美國(guó)Sigma公司），逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）試劑盒TakaPa RNA PCR Kit(Amv)Ver3.0（武漢博士德生物有限公司），Trizol核酸提取液（美國(guó)sigma公司）。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱（TC2323型，美國(guó)Sheloln），超凈工作臺(tái)（蘇州真田潔凈設(shè)備有限公司），相差倒置顯微鏡（ECLIPSETE300型，日本Nikon公司），96孔培養(yǎng)板，25 cm2培養(yǎng)瓶（日本Nuco公司產(chǎn)品），PCR基因擴(kuò)增儀（TC-48/T/H（a）杭州大和株式會(huì)社），電泳儀（杭州大和株式會(huì)社），DU640核酸/蛋白分析儀（美國(guó) BECKMAN COULTER）。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

固本補(bǔ)腎湯方藥：黃芪15 g、黨參10 g、枸杞子12 g、丹參15 g、當(dāng)歸12 g、肉蓯蓉10 g、王不留行15 g等。按劑量以農(nóng)本方（香港培力南寧藥業(yè)有限公司提供，每一味中藥濃縮劑均已獨(dú)立取得國(guó)家正式生產(chǎn)批文）溶于Hank's中，用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋至1 g/ml，1 500 r/min，離心5 min去除沉淀，用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)除菌，4℃保存?zhèn)溆谩ｈ蹤此崴舴移河缮虾ＨA聯(lián)制藥有限公司生產(chǎn)（國(guó)藥準(zhǔn)字H10910072），10 mg/片，用Hank's液溶解，用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋配制成1 ng/ml，制備方法同前。

1.2 方法

1.2.1 前列腺基質(zhì)細(xì)胞原代、傳代培養(yǎng)及純化、鑒定 在超凈臺(tái)上將前列腺組織剪為約1 mm3大小，采用組織塊貼塊法進(jìn)行接種，參照文獻(xiàn)[2-3]進(jìn)行原代及傳代培養(yǎng)（基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中加入雌二醇作為促增生劑），采用自然純化法、機(jī)械化除法、差速貼壁法純化基質(zhì)細(xì)胞。培養(yǎng)3～4代后基本上可得到純化的基質(zhì)細(xì)胞，采用RT-PCR法檢測(cè)平滑肌分化特異性蛋白smoothelin的表達(dá)（smoothelin片段：上游引物5-GGTCGAAGATGCTGCCCATCTT-3′、下游引物 5′-TCCGACAAAGGAAGAGAGACC-3′、片段長(zhǎng)度為 324 bp；同時(shí)以 β2微球蛋白引物擴(kuò)增片段作為內(nèi)參標(biāo)：上游引物5′-AGAGCTACCTGTGGAGCAACCT-3′、下游引物 5′-ATGCCTGCCGTGTGAACCATGT-3′、片段長(zhǎng)度為285 bp），檢測(cè)結(jié)果基質(zhì)細(xì)胞純度達(dá)98%。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)藥物細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 將制備的固本補(bǔ)腎湯溶液用DMEM培養(yǎng)液以幾何比稀釋?zhuān)瑢?duì)基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，觀察細(xì)胞情況，并根據(jù)光密度（optic density，OD）值計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的毒性作用[公式為：（藥物組平均OD-空白組平均OD）/空白組平均OD×100%]，取毒性作用＜15%的濃度作為觀察濃度。按細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)實(shí)驗(yàn)藥物高（10 ng/ml）、中（1 ng/ml）、低劑量組（0.1 ng/ml），他莫昔芬組，并設(shè)模型對(duì)照組及空白對(duì)照組，進(jìn)行干預(yù)培養(yǎng)，每組重復(fù)5瓶。

1.2.3 MTT法檢測(cè)固本補(bǔ)腎湯對(duì)前列腺基質(zhì)細(xì)胞的增殖作用影響 取第4代細(xì)胞懸液以4×104/ml濃度接種于96孔板，每孔500 μl，培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁，用Hank's液沖洗2次。換成含0.5%進(jìn)口馬血清的DMEM培養(yǎng)液24 h后，同時(shí)每孔加入含藥細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加500 μl，每濃度4個(gè)復(fù)孔，設(shè)他莫昔芬對(duì)照組5個(gè)，并設(shè)模型對(duì)照組5個(gè)，不含藥物，而加入等量的培養(yǎng)液（含雌二醇），另設(shè)空白對(duì)照組5個(gè)（培養(yǎng)液中不含雌二醇），在37℃，5%CO2恒溫箱中放置24 h，在每孔中加5 mg/ml MTT 20 μl，同樣條件下培養(yǎng) 4 h，終止培養(yǎng)，吸取孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入100 μl的二甲基亞砜，室溫下震蕩5 min，使結(jié)晶物充分溶解，在590 nm處測(cè)OD值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

在24 h時(shí)，他莫昔芬組及固本補(bǔ)腎湯各劑量組對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有都明顯的抑制作用，與模型組比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；固本補(bǔ)腎湯各劑量組之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01、P＜0.05）；低劑量組與他莫昔芬組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），中、高劑量組與他莫昔芬組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01、P＜0.05）。 見(jiàn)表1。

表1 固本補(bǔ)腎湯對(duì)基質(zhì)細(xì)胞增殖的影響（OD 590 nm，±s）

表1 固本補(bǔ)腎湯對(duì)基質(zhì)細(xì)胞增殖的影響（OD 590 nm，±s）

注：方差分析：F（OD）值=46.480，P＜0.01；與空白組比較，*P＞0.05，△P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.01；與他莫昔芬組比較，#P＞0.05，○P＜0.05，●P＜0.01；與低劑量組比較，☆P＜0.01，★P＜0.05；與中劑量組比較，◇P＜0.05

組別 例數(shù) OD值空白組模型組他莫昔芬組低劑量組中劑量組高劑量組555555 0.189±0.004 0.273±0.023△0.190±0.005*▲0.198±0.004*▲#◇0.211±0.008△▲○★0.226±0.004△▲●☆

3 討論

BPH是由于前列腺上皮或基質(zhì)細(xì)胞增生，引起的一系列下尿路梗阻癥狀，但BPH患者的臨床癥狀并不與增生的前列腺腺體大小成正比[4]組織學(xué)的研究提示了前列腺基質(zhì)成分在BPH發(fā)病中的重要性[5]。歷代醫(yī)家多將其歸屬于中醫(yī)“癃閉”的范疇。現(xiàn)行的中華人民共和國(guó)中醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》正式將其定名為“精癃”，病位在膀胱與精室。

《景岳全書(shū)·積聚》云：“凡脾腎不足及氣弱失調(diào)之人，多有積聚之病。”本病多由于年老體弱，或因年老陰陽(yáng)氣衰而致脾虛，氣化無(wú)力，日久痰濁瘀血留滯而成，屬本虛標(biāo)實(shí)。劉猷枋教授也提出腎氣虛、氣化不利和瘀血內(nèi)阻是BPH發(fā)生的最重要因素[6]。固本補(bǔ)腎湯方中黃芪、黨參益氣利水，大補(bǔ)脾氣而達(dá)到氣化得行，則小便自通的目的；丹參、當(dāng)歸活血化瘀，破宿血、補(bǔ)新血；王不留行活血通絡(luò)、利尿通淋；枸杞子、肉蓯蓉以補(bǔ)腎化氣。全方以益氣活血為主，輔以補(bǔ)腎之品，以達(dá)到補(bǔ)腎化氣、活血散結(jié)的作用。

本次研究通過(guò)MTT法檢測(cè)了固本補(bǔ)腎湯對(duì)體外培養(yǎng)人前列腺基質(zhì)細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明固本補(bǔ)腎湯能抑制體外培養(yǎng)前列腺基質(zhì)細(xì)胞的增殖，這可能是固本補(bǔ)腎湯治療良性前列腺增生癥的作用機(jī)制。

[1]劉本臣.中醫(yī)藥治療良性前列腺增生癥的研究進(jìn)展[J].甘肅中醫(yī),2007,20(12)：68-70.

[2]鄂征.組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)[M].北京：北京出版社,2001：35-38.

[3]司徒鎮(zhèn)強(qiáng),吳軍正.細(xì)胞培養(yǎng)[M].西安：興界圖書(shū)出版,2003：22-77.

[4]蔡蔚,朱閩,周青,等.前癃通膠囊治療良性前列腺增生癥36例臨床觀察[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2008,14(6)：74-76.

[5]陳輝熔,鄧春華,丘少鵬,等.前列腺增生病人前列腺基質(zhì)成分含量的變化[J].中華男科雜志,2001,7(6)：362-364.

[6]張亞強(qiáng),盧建新,宋豎旗.中醫(yī)藥治療前列腺疾病的研究現(xiàn)狀[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合外科雜志,2010,16(3)：255-258.