鹽酸戊乙奎醚對大鼠雙下肢缺血再灌注后心肌細(xì)胞凋亡的影響

張雄飛，潘道波

湖南省常德市第一人民醫(yī)院麻醉科，湖南常德 415000

肢體缺血再灌注（IR）較單純?nèi)毖獣r(shí)的損傷更損重，還可引起遠(yuǎn)隔多器官損傷[1]，雖然損傷的機(jī)制尚未完全明確，但與再灌注后中性粒細(xì)胞被激活，呼吸爆發(fā)釋放大量氧自由基及炎性細(xì)胞釋放大量炎性介質(zhì)有關(guān)[2]。鹽酸戊乙奎醚是新型選擇性抗膽堿藥物，對中樞和周圍神經(jīng)均具有很強(qiáng)的抗膽堿作用，作用全面、持續(xù)時(shí)間長，高度選擇性M1、M3受體拮抗作用，而對M2受體無明顯作用，在I/R和細(xì)胞保護(hù)功能上的作用越來越受到重視，但作用機(jī)制尚不明確[3]。本研究探討了鹽酸戊乙奎醚對大鼠雙下肢缺血再灌注后心肌細(xì)胞凋亡的影響，為臨床應(yīng)用提供可能的方向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠60只，由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，清潔級，雄性，體重（212±30）g，置實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中飼養(yǎng) 1周，自由攝食飲水。

1.2 試劑

SOD試劑盒、考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒和MDA試劑盒、MPO試劑盒 (南京建成生物工程研究所)，IL-10、TNF-α試劑盒，Bax和Bcl-2免疫組化試劑盒及細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(武漢博士德生物工程研究所)。

1.3 肢體缺血再灌注模型動(dòng)物的制備

大鼠術(shù)前12 h禁食，自由飲水。10%水合氯醛3 ml/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，4 h后追加1/2量。雙側(cè)股三角處切開皮膚，分離出股動(dòng)脈，用無創(chuàng)微動(dòng)脈夾于近腹股溝韌帶處夾閉股動(dòng)脈，使雙下肢缺血，縫合創(chuàng)口。以捫不到足背動(dòng)脈搏動(dòng)、雙足變暗變涼為缺血成功的標(biāo)志。4 h后打開原切口，去除動(dòng)脈夾恢復(fù)雙下肢血流，再灌注4 h，動(dòng)脈搏動(dòng)恢復(fù)，雙足逐漸變紅變暖，為建模成功。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及處理

實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為三組，分組各20只。①缺血再灌注組（H組）：再灌注前30 min腹腔注射2 ml生理鹽水；②鹽酸戊乙奎醚組（M組）：再灌注前30 min腹腔注射鹽酸戊乙奎醚2 mg/kg(用生理鹽水稀釋至2 ml)；③對照組（C組）：行假手術(shù)處理，無缺血再灌注，余手術(shù)麻醉步驟同①②。

1.5 標(biāo)本采集及處理

三組隨機(jī)各取10只觀察24 h存活率，余M組和H組均在再灌注4 h后在麻醉狀態(tài)下腹主動(dòng)脈放血活殺動(dòng)物，C組麻醉后同法活殺。迅速開胸取心肌，心尖部取HE染色標(biāo)本，余心肌-80℃超低溫冰箱凍存，待以后批量檢測MDA、SOD、MPO、IL-10、TNF-α。

1.6 觀察指標(biāo)及方法

快速用刀片將心尖部組織切下，生理鹽水沖洗干凈后投入10%甲醛固定24 h行HE組織染色。余心肌復(fù)溫后制成冷的心肌組織勻漿，分別用紫外分光光度計(jì)檢測SOD（黃嘌呤氧化酶法）、MDA (硫代巴比妥酸法)、MPO（髓過氧化物酶）、心肌組織蛋白（考馬斯亮蘭法）吸光度后再進(jìn)行計(jì)算SOD活力、MDA含量，酶標(biāo)儀檢測IL-10和TNF-α（ELISΑ法），嚴(yán)格按各試劑盒說明書操作。

1.6.1 Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)測定 10%甲醛固定，石蠟包埋切片，采用免疫組化染色法顯色。檢測方法嚴(yán)格按說明書操作。光鏡下觀察，陽性反應(yīng)為細(xì)胞漿呈棕黃色染色，不染色者為陰性。在高倍鏡（×400）下，拍攝組織切片圖像。每片隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)Bcl-2、Bax蛋白陽性表達(dá)細(xì)胞，以陽性細(xì)胞核數(shù)占細(xì)胞核總數(shù)的百分比為Bcl-2、Bax蛋白陽性表達(dá)指數(shù)（PEI）。

1.6.2 細(xì)胞凋亡檢測 采用原位缺口末端標(biāo)記法（TUNEL），檢測方法嚴(yán)格按說明書操作。細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞。計(jì)算5個(gè)高倍視野下（×400）的凋亡細(xì)胞數(shù)，以凋亡細(xì)胞個(gè)/100細(xì)胞表示凋亡指數(shù)（apotosis index，AI）。

1.6.3 組織病理學(xué)檢查 10%甲醛中固定心肌組織，石蠟包埋切片，染色后光鏡下觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 心肌組織形態(tài)學(xué)變化

C組心肌細(xì)胞大小、形態(tài)均正常。H組可見心肌組織水腫、炎性細(xì)胞浸潤、局灶性出血等，而M組心肌組織病理改變均較H組有所減輕。

2.2 心肌組織 MDA、SOD、MPO、TNF-α 和 IL-10、AI水平

再灌注后，即H組較C組心肌組織MDA、MPO、TNF-α和 IL-10 水平、Bax表達(dá)、AI均明顯升高(P＜0.05)，而 SOD 活性、24 h生存率降低（P＜0.05）；使用鹽酸戊乙奎醚后，即 M組較H組SOD活性、IL-10含量、24 h生存率均升高（P＜0.05），MDA、MPO、TNF-α 含量、Bax表達(dá)、AI均明顯降低（P＜0.05）。 見表1～2。

表1 心肌組織 SOD 活性、MDA、MPO、TNF-α、IL-10 含量（n=10，±s）Tab.1 The MDA activity and the content of MDA,MPO,TNF-α,IL-10 in myocardial tissue(n=10,±s)

表1 心肌組織 SOD 活性、MDA、MPO、TNF-α、IL-10 含量（n=10，±s）Tab.1 The MDA activity and the content of MDA,MPO,TNF-α,IL-10 in myocardial tissue(n=10,±s)

注：與 C 組比較，﹡P＜0.05；與 H 組比較，﹟P＜0.05

C組H組M組組別 SOD(U/g) MDA(nmol/mgprot)270±64 148±49﹡213±71﹟0.84±0.22 1.76±0.47﹡0.94±0.23﹟MPO(U/g.wet)0.93±0.11 1.27±0.15﹡1.04±1.10﹟IL-10(pg/mg.wet)18.13±2.68 32.18±8.97﹡46.4±11.47﹡﹟TNF-α(pg/mg.wet)120±30 290±117﹡169±45﹡﹟

表2 心肌組織Bcl-2、Bax陽性表達(dá)指數(shù)、AI和24 h生存率（n=10，±s）Tab.2 The PEI of Bcl-2,Bax and the apoptosis index in myocardial tissue and survive rate in the three group(n=10，±s)

表2 心肌組織Bcl-2、Bax陽性表達(dá)指數(shù)、AI和24 h生存率（n=10，±s）Tab.2 The PEI of Bcl-2,Bax and the apoptosis index in myocardial tissue and survive rate in the three group(n=10，±s)

注：與 C 組比較，◆P＜0.05；與 H 組比較，●P＜0.05

C組H組M組組別 Bcl-2 0.087±0.020 0.091±0.024 0.096±0.015 Bax 0.095±0.020 0.157±0.032◆0.120±0.027◆●AI(%)0.95±0.24 5.97±1.00◆3.91±0.87◆●24 h生存率（%）100 20◆50◆●

2.3 相關(guān)性分析結(jié)果

MDA與 Bax顯著正相關(guān)（相關(guān)系數(shù) r=0.483，P＜0.05）MDA與AI之間顯著正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)r=0.738，P＜0.01）。

3 討論

近年實(shí)驗(yàn)證實(shí)，急性肢體缺血再灌流后不但損傷肢體本身，還可誘導(dǎo)產(chǎn)生全身炎癥綜合征（SIRS），造成遠(yuǎn)隔器官（肝、肺、腦、腎、心等）損傷，中性粒細(xì)胞及活性氧物質(zhì)所引起的炎癥和氧化應(yīng)激性損傷可能是其發(fā)生的主要因素[4]。

IL-10在炎癥反應(yīng)中主要發(fā)揮抗炎因子的作用。MPO可定量表達(dá)中性粒細(xì)胞（PMN）的聚集程度，兩者的表達(dá)平衡可反映心肌局部炎癥反應(yīng)和中性粒細(xì)胞聚集的程度。體內(nèi)氧自由基主要由黃嘌呤氧化酶及中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)產(chǎn)生，局部炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致氧自由基大量產(chǎn)生，使細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化、DNA破壞等損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。由于氧自由基具有極強(qiáng)的反應(yīng)活潑性，半衰期短，難以捕捉，常通過體內(nèi)氧化-抗氧化系統(tǒng)間接反映體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生情況，SOD是清除O2-的專一歧化酶，反映了體內(nèi)抗氧自由基能力。MDA反映了機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度，間接反映組織內(nèi)自由基水平[5]。Bcl-2是重要的抗凋亡因子，而Bax促進(jìn)凋亡。Bcl-2與Bax表達(dá)平衡與細(xì)胞凋亡途徑緊密相關(guān)。Bxl-2表達(dá)下調(diào)和（或）Bax上調(diào)都顯示細(xì)胞凋亡增加。本研究顯示，雙下肢I(xiàn)R后IL-10和MPO明顯升高，MDA大量產(chǎn)生，SOD活性明顯下降，Bcl-2無顯著變化，Bax蛋白陽性表達(dá)指數(shù)增加，Bax/Bcl-2比例升高，而使用鹽酸戊乙奎醚IL-10進(jìn)一步升高，MPO下降，SOD活性明顯上升，MDA產(chǎn)生減少，Bax/Bcl-2比例下降；相關(guān)性分析結(jié)果顯示MDA分別與Bax和AI顯著相關(guān)。表明雙下肢I(xiàn)R心肌中性粒細(xì)胞聚集，局部炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，抗氧化機(jī)制受到破壞；大量氧自由基釋放，誘導(dǎo)Bax促凋亡因子釋放，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡；鹽酸戊乙奎醚通過抑制心肌局部炎癥反應(yīng)，使自由基生成減少，從而抑制Bax促凋亡因子產(chǎn)生，最后減少AI，這可能與抗膽堿藥能穩(wěn)定溶酶體和線粒體等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，減少溶酶體酶的釋放，抑制花生四烯酸代謝物的產(chǎn)生和休克因子的形成，達(dá)到細(xì)胞保護(hù)作用有關(guān)[6]。

TNF-α是單核/巨噬細(xì)胞和其他促炎細(xì)胞激活后釋放的細(xì)胞因子，水平升高比其他細(xì)胞因子更快，為最早的重要內(nèi)源性介質(zhì)之一，TNF-α與TNFRⅠ受體結(jié)合后激活caspases導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：肢體缺血-再灌注后，心肌組織勻漿中TNF-α較對照組明顯增高，在一定程度上反映TNF-α在肢體缺血-再灌注心肌損傷過程所起的重要作用，而鹽酸戊乙奎醚組顯著下降提示鹽酸戊乙奎醚降低心肌TNF-α的濃度，在抑制TNF-α誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡方面有現(xiàn)實(shí)的臨床意義。

總之，肢體缺血IR激活PMNs及其他炎性細(xì)胞，產(chǎn)生大量氧自由基及炎性介質(zhì)，使機(jī)體處于一種無法控制的過度炎癥反應(yīng)狀態(tài)，引起心肌損傷，心肌細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)表明，鹽酸戊乙奎醚能夠有效減輕肢體缺血再灌注損傷后引起心肌損傷，清除心肌氧自由基，提高機(jī)體抗氧化能力，減輕心肌炎癥反應(yīng)，減少TNF-α等凋亡誘導(dǎo)因子產(chǎn)生，從而從內(nèi)外源兩條途徑發(fā)揮抗凋亡作用。可能機(jī)制為選擇性抗膽堿作用而不增加心率，有利于減少心肌氧耗，減輕肢體IR心肌損傷；改善微循環(huán)，拮抗炎癥因子及炎癥介質(zhì)，保護(hù)細(xì)胞膜及溶酶體膜，降低毛細(xì)血管通透性等，可減輕局部炎癥反應(yīng)，緩解心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)揮作用。

[1]林大偉,菅向東.新型選擇性抗膽堿藥長托寧的臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國工業(yè)醫(yī)志,2008,21(1)：60-62.

[2]Di Napoli P,Taccardi AA,De Caterina R,et al.Pathophysiology of ischemia-reperfusion injury：experimental data[J].Italian heart journal：official journal of the Italian Federation of Cardiology,2002,34：24-28.

[3]Shao QW,Xue TY,Gao JZ,et al.Effect of proteasome inhibitors MG-132 at different doses on cultured K562 cell apotosis[J].Zhongguo shi yan xue ye xue za zhi,2009,17：574-578.

[4]Kawasaki S,Sugiyama S,Ishiguro N,et al.Implication of superoxide radicals on ischemia-reperfusion-induced skeletal muscle injury in rats[J].Eur Surg Res,1993,25：129-136.

[5]He LL,Sun GZ,Zhang PT.Apoptotic protease activating factor 1 inducing apotosis and related anti-tumor therapy——review[J].Zhongguo shi yan xue ye xue za zhi,2009,17：251-254.

[6]Zhang D,Lei Y,Zhao J,et al.The change of certain biochemical indexes and apotosis protein(Fas/FasL)expression in rat liver of selenium and iodine deficiency[J].Wei Sheng Yan Jiu,2008,37：682-684.