類風濕關節炎患者外周血白細胞介素-23和類風濕因子的表達研究

張國華 ，呂 智

1.山西醫科大學第二臨床醫學院，山西太原 030001；2.山西醫科大學汾陽學院，山西汾陽 032200

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以關節滑膜組織慢性炎癥病變為主要表現的器官特異性自身免疫性疾病，主要病理特征是慢性炎癥細胞（T細胞和巨噬細胞）浸潤和多種細胞因子分泌，最終導致關節滑膜漸進性損傷及骨質破壞，給患者帶來了很大的痛苦[1]。其病因和發病機制至今尚不完全清楚，在我國，RA的患病率為0.32%～0.36%，是造成人類勞動力喪失和致殘的主要因素之一[2]。近年來，大量研究證實，RA患者滑膜細胞及滑膜組織中浸潤的單核/巨噬細胞、淋巴細胞等可產生大量的細胞因子和炎癥介質，參與RA的致病過程[3-4]。

白細胞介素23（IL-23）屬于IL-12家族成員，是一種重要的炎癥細胞因子，在抗感染免疫、抗腫瘤免疫及自身免疫性疾病中發揮重要作用[5]。IL-23可能與RA炎癥反應、血管新生、關節軟骨、滑膜病變之間存在一定的內在聯系，目前國內對IL-23在RA早期診斷和治療等方面的相關報道較少，故從基因水平和蛋白水平探討IL-23在RA患者體內的表達及其與RF的關系，為RA的早期診斷和進一步闡明RA的發病機制提供理論依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象

66例RA患者均來自山西省汾陽醫院門診或住院患者，均符合1987年美國風濕病學會（ARA）制定的類風濕關節炎診斷標準，其中，男 24例，女 42例；年齡 27～65歲，平均（47.3±7.2）歲。均排除高血壓、糖尿病、肝腎疾病、感染、腫瘤、心腦血管疾病和其他自身免疫性疾病等。42例健康對照組為健康體檢者，其中，男14例，女28例；年齡23～66歲，平均（46.5±7.8）歲。

1.2 臨床標本的采集

所有研究對象采集空腹靜脈血2管，第一管全血3 ml，置于肝素抗凝管中，用于分離外周血單個核細胞（PBMC）。第二管無抗凝劑3 ml，靜置30 min，離心后取血清，用于酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測IL-23和免疫比濁法檢測血清RF水平。

1.3 外周血單個核細胞的分離

抽取3 ml淋巴細胞分離液（購自北京索萊寶科技有限公司）于無菌離心管中，將新鮮無菌留取的3 ml肝素抗凝血用等體積（3 ml）無菌生理鹽水（1∶1）稀釋后，緩慢加入到已裝有淋巴細胞分離液的離心管中，水平離心機離心（2 000 r/min，20 min），吸取中間的白膜層（PBMC），用5倍體積的無菌生理鹽水洗滌2次，最后用無菌生理鹽水稀釋至細胞濃度為1×107/ml。

1.4 RNA提取和逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）

1.4.1 RNA提取 將上述分離的PBMC按5×106個細胞中加入1 ml Trizol溶液，反復吹打使細胞徹底裂解。按1 ml Trizol加 200 μl氯仿（5∶1），劇烈震蕩 15 s，室溫靜置 5 min，4℃離心（12 000 r/min，15 min），小心吸取上清，按與上清 1∶1 的比例加入異丙醇（約 450 μl），上下顛倒混勻后，-20℃靜置 60 min，4℃離心（12 000 r/min，10 min），仔細將液體倒掉，加入 1 ml 75%的乙醇（DEPC 水配制），4℃離心（12 000 r/min，10 min）洗滌沉淀1次，加入適量DEPC處理水（20 μl）溶解 RNA，測OD值定量，以A260/A280，A260/A230比值判斷RNA樣品質量，-70℃冰箱保存備用。

1.4.2 引物設計 根據GenBank人IL-23p19 cDNA序列設計引物，以β-actin作為內參照。引物序列由上海英俊生物技術有限公司合成。IL-23p19（328 bp）：上游引物（5′-CTGCTTGCAAAGGATCCACC-3′），下游引物（5′-TTGAAGCGGAGAAGGAGACG-3′）。 β-actin（600 bp）：上游引物（5′-CACACTGTGCCCATCTACGA-3′），下游引物（5′-CTGCTTGCTGATCCACATCT-3′）。

1.4.3 RT-PCR 選用TaKaRa公司的PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2，按試劑盒說明書操作，通過預實驗確定PCR反應條件和最適循環數，以保證PCR產物量與起始mRNA量呈線性相關。反應結束后取5 μl PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像分析儀（江蘇捷達科技發展有限公司）上觀察拍照，分析電泳條帶的光密度值，以β-actin作內參照，用相對光密度值代表mRNA的表達量。相對光密度值=（IL-23p19光密度值/β-actin光密度值）×100%。

1.5 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）

采用雙抗體夾心ABC-ELISA法，人IL-23 ELISA檢測試劑盒購自上海森雄科技實業有限公司（批號：SX01087），操作過程均嚴格按試劑說明書操作。采用BIO-RAD伯樂酶標儀680于492 nm波長處測定OD值，通過繪制標準曲線計算樣本的濃度。

1.6 免疫比濁法

檢測血清RF用OLYMPUS全自動生化分析儀（北京九強公司），所用試劑為原裝配套試劑，檢測正常范圍＜14 IU/ml。

1.7 統計學分析

所有數據均采用SPSS 11.5軟件進行統計學分析。數據用均數±標準差（±s）表示，兩組間均數比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。各指標間的相關性檢驗采用Pearson相關性分析。

2 結果

2.1 RA患者與健康對照者PBMC中IL-23p19 mRNA表達水平比較

RT-PCR電泳圖中可見，健康對照組和RA患者組在328 bp處都有條帶出現，但在RA患者組的表達強度明顯高于對照組（圖 1、表1），說明RA患者PBMC中 IL-23p19 mRNA的平均表達水平較健康對照組顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05，表1）。

表1 IL-23p19 mRNA和血清IL-23的平均表達水平（±s）Tab.1 The average expression level of IL-23p19 mRNA and serum IL-23(±s)

表1 IL-23p19 mRNA和血清IL-23的平均表達水平（±s）Tab.1 The average expression level of IL-23p19 mRNA and serum IL-23(±s)

注：與健康對照相比，*P＜0.05Note：compared with the healthy group,*P＜0.05

RA組健康對照組組別 例數66 42 IL-23p19 mRNA（%）45.2±11.7*23.8±9.5血清 IL-23（ng/L）114.47±42.70*70.81±28.85

2.2 RA患者與健康對照者血清IL-23水平比較

RA患者血清中IL-23水平較健康對照組顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

2.3 RA患者IL-23與RF之間的相關性分析

RA患者血清IL-23含量與RF含量無明顯相關性（r=0.389，P＞0.05)。

3 討論

類風濕關節炎是多因素自身免疫性疾病，其病因及發病機制仍不十分清楚，現在免疫機制越來越受到國內外專家的關注。RA患者體內多種細胞因子和炎癥介質異常表達，它們之間通過相互作用、相互調節，形成一個復雜的網絡，可能直接或間接參與RA的發生和發展過程[6]。IL-23是2000年報道的細胞因子，是由p19和IL-12p40共同形成的類似于IL-12p35p40的、由二硫鍵連接的異源二聚體可溶性復合物。其功能研究證明，p19單獨不具有生物學活性，只有與p40共同構成p19p40時才有生物學活性。IL-23雖然與IL-12共有p40亞單位，但以其自身獨特的亞單位p19與IL-12相區別。IL-23具有十分復雜的生物學功能，主要作用于記憶性CD4+T細胞，誘導Th1型細胞的分化及IFN-γ產生[7]，還可作用于記憶性Th17細胞亞群誘導產生IL-17，參與免疫炎癥[8]。過去人們認為IL-12在自身免疫性炎癥發揮中心作用，現在越來越多的研究表明在強直性脊柱炎（AS）、橋本甲狀腺炎（HT）等患者體內IL-23的表達明顯增高[9-10]，所以IL-23在這些自身免疫性疾病的發展過程中可能發揮著重要的作用。但目前對于IL-23在RA發病中的作用沒有研究報道，本研究結果表明IL-23p19 mRNA和血清IL-23在RA組的表達水平都顯著高于正常對照組，差異具有統計學意義，說明IL-23參與了RA的炎癥過程，但具體作用機制有待進一步研究。

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