化學發光免疫分析技術及其進展

陳海斌

1 歷史背景

很早以來就有一些學者試圖將抗體分子與一些示蹤物質結合，利用抗原抗體反應進行組織或細胞內抗原物質的定位。Coons[1]等于1941年首次采用熒光素作為標記物，紫外光激發發光，借助熒光顯微鏡來測定可溶性肺炎球菌多糖抗原而獲得成功。熒光免疫分析（fluoroimmunosassay FIA）技術是標記免疫技術中發展最早的一種。傳統熒光免疫分析受到散射光、樣品的背景熒光和熒光淬滅等因素的干擾,分析靈敏度較低；同時由于FIA所需儀器較復雜，限制了它的應用。

1959年,美國科學家Yalow和Bersono[2]創建了具有劃時代的放射免疫分析技術(radioimmunoassay,RIA)，用于血清中胰島素含量的測定。RIA的建立是檢測方法的重大突破。其優點是：成本底、靈敏度高；周圍環境和干擾物質對檢測結果的影響較小；與同位素結合的抗原或抗體不影響基本的免疫反應；放射測量體系齊全。其缺點是：同位素的半衰期短，試劑盒不易儲存；不易實現自動化；由于放射性同位素的使用帶來了污物處理的難題，對環境和操作人員帶來潛在的危害。

1966年，Engrall[3]等人將抗原抗體特異性免疫反應和酶的高效催化作用相結合，用特定的酶標記抗原或抗體，使之成為具有示蹤活性的免疫酶，根據免疫酶催化底物的顯色程度，對待測物進行定性或定量測定，建立了酶免疫分析法(Enzyme Immunoassay EIA)。該法克服了RIA中放射性污染的弊端，具有設備簡單，操作安全等優點。這種依靠比色法或偏振光法的檢測技術存在酶不穩定，光度測量范圍窄，靈敏度不高，難以定量、易造成漏診和假陽性等不足，受到了應用上的限制。

1977年，Halmann[4]在RIA和EIA基本理論的基礎上，以化學發光信號示蹤，建立了化學發光免疫分(ChemiluminesentImmunoassay CLIA)技術。早期的CLIA具有和RIA相似的特異性, 但因光信號持續時間太短，靈敏度低于RIA,達不到臨床應用水平。90年代初首先由英國Amersham公司研究人員發現在HRP催化的Luminol發光反應中加微量對碘酚作為發光穩定劑，可以使發光信號持續20～30 min。隨后生產出試劑盒，標示了化學發光技術進入了臨床應用的開端。1990年Leland[5]等人建立了電化學發光反應系統之后,以電子得失過程中的電位差作能量激發源的電化學發光免疫分析(Electrochemiluminescence immunoassay ECLIA)，與CLIA相比:靈敏度更高，線性范圍在6個數量級，下限達1 pmol；檢測速度更快，僅需幾分鐘到十幾分鐘。不同標記物免疫檢測技術的靈敏度、線性范圍和試劑有限期的比較如圖1-3：

2 基本原理

化學發光免疫分析含有免疫分析和化學發光分析2個系統[6]。免疫分析系統是將化學發光物質或酶作為標記物,直接標記在抗原或抗體上,經過抗原與抗體反應形成抗原-抗體免疫復合物。化學發光分析系統是在免疫反應結束后,加入氧化劑或酶的發光底物,化學發光物質經氧化劑的氧化后,形成一個處于激發態的中間體,會發射光子釋放能量以回到穩定基態,發光強度可以利用發光信號測量儀器進行檢測，根據化學發光標記物與發光強度的關系,可利用標準曲線計算出被測物的含量[7]。

3 常見的發光體系

3.1 魯米諾、異魯米諾及其衍生物類

魯米諾（luminol）、異魯米諾（isoluminol）及其衍生物是最早在CLIA中使用的一種常用的化學發光物質[8-10]這類物質的發光為氧化反應發光，它們在堿性條件下通過辣根過氧化物酶（HRP）催化，被H2O2氧化生成3-氨基鄰苯二酸的激發態中間體,當其回到基態時發出光子。魯米諾的發光光子產率約為0.01，最大發射光波長為425 nm。早期用魯米諾直接標記抗原或抗體，但由于標記后發光強度降低而使其靈敏度受到影響，近年來改用HRP標記抗原或抗體，免疫反應后，利用魯米諾作發光底物，在發光啟動試劑(NaOH+H2O2)作用下，魯米諾發光，發光強度依賴于免疫反應中酶的濃度。如果不使用增強劑，魯米諾體系的發光基本上為閃光型且信號弱。目前通常采用的體系是luminol/H2O2/HRP/Enhance System，如圖4所示，即用HRP標記抗原或抗體，以魯米諾或異魯米諾及其衍生物作發光底物，對碘苯酚或對苯基酚等作增強劑，用NaOH+H2O2作發光啟動試劑，化學發光反應2 min后，光發射強度達到最高峰。使用增強劑后發光的持續時間可延長至30～60 min,發光強度至少增加1000倍以上，并且“本底”發光顯著降低。

3.2 吖啶類化合物

光澤精是第一個被發現有化學發光性質的吖啶類化合物,Klee等[11]研究合成了更穩定的吖啶酯衍生物，它們應用于CLIA通常采用的體系是Acridimium ester/H2O2系統，如圖示5。即用吖啶酯或吖啶磺酰胺標記抗體或抗原，用HNO3+H2O2+NaOH做發光啟動試劑，發光機理是：在堿性H2O2溶液中，當其受到過氧化氫離子進攻時，生成一個有張力的不穩定的二氧乙烷，此二氧乙烷分解為CO2和電子激發態的N-甲基吖啶酮，當其回到基態時發出一最大發射波長為430 nm的光子。吖啶類化合物的發光效率高，量子產率可達0.05，作為標記物用于免疫分析，其發光體系簡單、快速，不需要加入催化劑，也不需要增強劑，從而降低了背景發光，提高了信噪比，干擾作用少。

3.3 （金剛烷）-1,2-二氧乙烷及其衍生物

該發光體系是目前最重要、最靈敏的一類發光體系,其主要代表是Bronstein等[12]提出的ALP-AMPPD發光體系。AMPPD是一種超敏感的AP底物,它首先在AP的特異催化下迅速脫磷酸基生成AMPD-陰離子中間體(半衰期2～30 min), 此不穩定的中間體經分子內電子轉移裂解為一分子的金鋼烷酮和一分子處于激發態的間氧苯甲酸甲酯陰離子，當回到基態時發出發出λ max為477 nm的光，并可持續幾十分鐘，其發光機理如圖6所示。該體系中溶液的pH增高會增強發光強度,實驗證明最佳pH為9.0,在該體系中加入水溶性的大分子物質牛血清白蛋白(BSA)或十四烷酰氨基熒光素與十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)構成的水溶性膠粒,可使發光強度增強400倍。該化學發光體系有發光持續而穩定的特點。應用于CLIA通常采用的體系是Dcridinium ester/AP/Enhance System, 即用堿性磷酸酶(AP)標記抗原或抗體，用（金剛烷）-1,2-二氧乙烷及其衍生物做發光底物，在發光底物中加入增強劑。對AMPPD加以改進的CSPD、CDP-Sta具有更好反應動力學，它們的穩定性、信噪比和靈敏度有更一步提高，是新一代化學發光物質。

3.4 電化學發光體

電化學發光免疫分析(Electrochem iluminescence,ECL)是指由電化學反應引起的化學發光過程。圖示7。ECL的反應在電極表面進行,發光底物為三聯吡啶釕,三丙胺(TPA)用來激發光反應。在陽極表面,兩種物質同時失去電子。在電極板上被氧化成TPA也被氧化成陽離子自由基(TPA+*),TPA+*自發地釋放一個質子而變成非穩定分子(TPA*),將一個電子遞形成激發態的在衰減的同時發射一個波長為620 nm的光子,重新回到基態這一過程在電極表面反復進行, 發光過程中的標記物基本不被消耗，產生高效、穩定的連續發光,并不斷增強[13]。ECL的突出優點是:①標記分子小,可實現多標記,標記物非常穩定;②發光時間長,靈敏度高，最小檢出值可達1 pmol以下；③光信號線性好,動力學范圍寬,超過6個數量級;④可重復測量,重現性好;⑤可實現多元檢測和均相免疫分析;⑥快速,完成一個樣品的分析通常只需18 min;⑦可實現全自動化[15]。其缺點是：反復使用的流動池可能導致交叉污染；而沖洗或進樣中產生的氣泡也會干擾測定；同時繁瑣冗長的沖洗過程也會成為提高檢測效率的瓶頸。另外使用磁性或非磁性微粒時，強烈的散射吸收作用也會降低靈敏度。目前商品化的ECL分析系統只有Roche公司的ECL全自動分析系統。

3.5 生物發光體系

北美熒火蟲體內的熒光素/熒光素酶是著名的生物化學發光體系,它由蟲熒光素酶、蟲熒光素[D-(-)-2-6’-羧基-2’苯并噻唑-△2-噻唑啉-4-羧酸]、ATP、Mg2+及O2所組成。蟲熒光素酶在催化時,首先與蟲熒光素酰腺苷酸(由Mg2+-ATP與蟲熒光素復合而成)生成復合物,然后該復合物放出質子,酶變構導致蟲熒光素氧化脫羧并發射光子。另一生物發光體系是水母發光蛋白,它不需要加入熒光素酶,只需加入Ca2+或Se2+便能通過分子內反應而發出λ max為470 nm的藍光。生物發光體系的特點是發光效率、靈敏度、選擇性均非常高[13]。

3.6 其他無機氧化劑的化學發光體系

孫秀新[14]等就近幾年來一些無機氧化劑直接氧化一些物質產生化學發光的化學發光新體系,如高錳酸鉀、鈰(Ⅳ)、過氧化氫、高碘酸鉀、次氯酸鹽和鐵氰化鉀等在藥物分析方面的應用和研究進行過綜述。

4 小結

化學發光免疫分析是根據放射免疫分析的基本原理，將高靈敏度的化學發光技術與高特異性的免疫反應結合起來，借以檢測微量抗原或抗體的一種新型非放射標記免疫分析技術。CLIA具有靈敏度高、檢測范圍寬、操作簡便快速、標記物穩定性好、無污染、儀器能實現自動化等優點。CLIA應用范圍較廣,既可檢測不同分子大小的抗原、半抗原和抗體,又可用于核酸探針的檢測。CLIA與放射免疫分析(RIA)、熒光免疫分析(FIA)及酶免疫分析(EIA)相比,具有標記物制備容易、不污染環境、穩定性高、并可實現全自動化等優點，提供了一種痕量或超痕量的非放射性免疫檢測手段。是目前已有的各種免疫分析中最完善的分析方法，是免疫分析重要的發展方向。

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[3]Engrall E．PerlmannP．Enzymelinked immunosorbent assay (ELISA)quantitative assay of immunoglobulinG[J]．Immunochemistry, 1971,8:871-874．

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