還少丹對D-半乳糖衰老模型小鼠心肌線粒體DNA缺失的影響

程莉娟，劉群良*，譚 峰，胡 梅，周賽男

（湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208）

還少丹對D-半乳糖衰老模型小鼠心肌線粒體DNA缺失的影響

程莉娟，劉群良*，譚 峰，胡 梅，周賽男

（湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208）

目的 探討還少丹對D-半乳糖(D-gal)誘導的衰老小鼠心肌線粒體DNA（mtDNA）缺失的影響。方法 將40只小鼠隨機分為空白對照組、衰老模型組、還少丹低、高劑量組，用D-半乳糖建立衰老模型，分別給予蒸餾水和還少丹水煎液灌胃。連續給藥6周后，采用聚合酶鏈反應（PCR）技術擴增心肌組織mtDNA，經瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增條帶，用光密度掃描定量各組mtDNA的缺失率。結果 空白對照組未見mtDNA缺失型擴增條帶，其余各組均出現不同程度的缺失型擴增條帶；與模型組比較，低、高劑量組小鼠心肌mtDNA缺失率明顯降低，差異均具有統計學意義（P<0.05）；而低劑量與高劑量組之間比較mtDNA的缺失率差異無統計學意義(P>0.05)。結論 還少丹能減少D-半乳糖誘導的衰老小鼠心肌mtDNA的缺失程度，提示該方能降低mtDNA的氧化損傷，保護mtDNA的結構完整性，從分子水平上為還少丹抗衰老的作用機制提供了一定的實驗依據。

還少丹；衰老；心肌；線粒體DNA；小鼠；何首烏；熟地；肉蓯蓉

線粒體是除細菌、藍綠藻及哺乳動物的成熟紅細胞之外，所有真核細胞均含有的細胞器，它是細胞能量產生與轉換的重要場所。線粒體擁有一套自身的遺傳控制系統，同時又受到核DNA（nDNA）的調控。隨著分子生物學的發展，線粒體在衰老中的作用越來越被人們所認識并引起關注。mtDNA突變不僅可導致器官老化，而且可引發多種老年性疾病[1]。本研究擬采用D-半乳糖衰老氧化損傷模型小鼠，利用PCR技術研究小鼠心肌mtDNA的缺失程度，探討還少丹延緩衰老的機制。現將實驗方法及結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級昆明種小鼠，40只，雌性，7月齡，體質量（47.4±4.3）g，由湖南中醫藥大學實驗動物中心提供，合格證號［SCXK（湘）2009-0004］。

1.1.2 藥物 還少丹由何首烏、熟地、肉蓯蓉等中藥組成，購自湖南省藥材公司。還少丹水煎液：取310 g中藥加800 mL水，煎煮1 h，過濾離心，取濾渣及沉淀加水煎煮1 h后再過濾離心，合并2次濾液，加熱濃縮至濃度為1 g／mL（生藥），置冰箱4℃冷藏保存備用。

1.1.3 試劑 D-半乳糖為美國Amresco公司產品；蛋白酶K為美國Merck化工技術公司產品；dNTP和Taq酶為大連TaKaRa生物工程有限公司產品；引物為上海博尚生物公司產品；其它試劑均為國產分析純。

1.1.4 儀器 TGL-16高速冷凍離心機（湖南儀器廠）；WD-9402A型PCR擴增儀（北京六一儀器廠）；Champ Gel 5500系列凝膠成像分析儀（北京賽智創業科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將40只雌性小鼠，按體質量隨機分為4組，分別為空白對照組、衰老模型組、還少丹低、高劑量組，每組10只。

1.2.2 動物模型的制備及給藥方法 在無菌條件下，將D-gal用生理鹽水配制成1 g/dl的D-gal溶液，以 100 mg/（kg·d）的劑量，給衰老模型組、還少丹低、高劑量組小鼠頸部皮下注射6周，建立衰老模型。空白對照組頸部皮下注射等量生理鹽水；同時，用還少丹水煎液給還少丹低、高劑量組灌胃。小鼠用藥劑量按70 kg成人與20 g小鼠體表面積比值換算。低劑量組用還少丹水煎液10 mg/g灌胃（相當于成人劑量的等效劑量），高劑量組用還少丹水煎液20 mg/g灌胃（相當于成人劑量的2倍）。空白組和模型組給予等量的蒸餾水灌胃。每周灌胃5 d，另2 d自由飲藥，連續給藥6周。

1.2.3 小鼠心肌組織DNA提取 參照文獻[2]的方法，小鼠頸椎脫臼法處死，立即取心臟綠豆大小組織，剪碎，加入1 mL細胞裂解液裂解細胞，加入蛋白酶K至終濃度為200μg/mL，室溫震蕩消化2 h。用酚、氯仿、異戊醇（酚∶氯仿∶異戊醇 25∶24∶1）法，提取心肌組織總DNA，再用無水乙醇沉淀，洗滌純化，用紫外分光光度法檢驗提取DNA的質量和濃度。將符合純度要求的DNA，置-20℃保存備用。

1.2.4 PCR擴增及產物半定量分析 引物設計參照文獻[3-5]，擴增小鼠心肌mtDNA最常見的缺失類型—3 867 bp片段的缺失，采用3條引物，各參數見表1。其中L1、H擴增缺失型mtDNA，獲得630 bp片段，反映mtDNA的缺失量；L2、H擴增野生型mtDNA，獲得468 bp片段，反映正常mtDNA的含量。PCR 反應體系為 20 μL，含 4×dNTP 各 200 μmol/L，引物各 0.25 μmol/L，DNA 模板 0.2μg，Taq 酶 1.5 U。循環條件為：94℃變性45 s，53℃退火30 s，72℃延伸45 s，共30循環；末次延伸7 min。擴增產物20 μL經1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，凝膠掃描系統拍照，并對野生型mtDNA條帶及缺失型mtDNA條帶進行積分光密度測定，以缺失型mtDNA量/(缺失型mtDNA量+野生型mtDNA量)的百分比率，反映心肌mtDNA3867bp的缺失程度。

1.3 統計學分析

所有數據采用SPSS 17.0統計軟件統計分析，結果用“”表示，組間比較采用單因素方差分析。

表1 引物設計參數

2 結果

2.1 還少丹對小鼠心肌mtDNA的PCR產物電泳的影響

各組小鼠心肌組織均擴增得到野生型mtDNA 468 bp條帶；衰老模型組、還少丹低劑量組和還少丹高劑量組小鼠心肌組織還可見630 bp缺失型mtDNA條帶，空白對照組小鼠心肌組織未擴增出缺失型mtDNA條帶。見圖1。

圖1 各組小鼠mtDNA PCR擴增電泳圖

2.2 還少丹對小鼠心肌mtDNA缺失率的影響

空白對照組小鼠心肌未見缺失型mtDNA，其余各組經凝膠成像光密度掃描定量分析。與衰老模型組比較，還少丹低、高劑量組小鼠心肌mtDNA缺失程度均明顯降低（P<0.05）；還少丹低劑量組和還少丹高劑量組之間mtDNA缺失程度的差異無統計學意義(P>0.05)。結果見表2。

表2 各組小鼠心肌mtDNA缺失率的比較 （，%）

表2 各組小鼠心肌mtDNA缺失率的比較 （，%）

注：與衰老模型組比較*P<0.05；與還少丹低劑量組比較△P>0.05。

藥物劑量 缺失率mtDNA/（mg/g） 總mtDNA光密度比值空白對照組 10 — 0.000 00±0.000 00衰老模型組 10 — 0.032 76±0.003 08還少丹低劑量組 10 10 0.018 79±0.001 19*還少丹高劑量組 10 20 0.020 51±0.000 32*△組 別 n

3 討論

近年來，眾多學者提出線粒體DNA與衰老的關系，認為mtDNA的氧化損傷引起mtDNA突變的累積,可導致能量產生缺陷、衰老和細胞死亡[6]。mtDNA主要功能是與氧化磷酸化有關，哺乳動物的mtDNA具有37個編碼基因，包括22個tRNA基因、2個rRNA基因和13個氧化磷酸化相關蛋白基因[7]。由于mtDNA處于高氧自由基環境，且呈裸露狀態而缺乏組蛋白的保護，加之損傷修復機制不完善，極易受到氧化損害而發生突變。盡管其突變率非常低，但隨個體增齡呈顯著性增高趨勢[1]。mtDNA突變導致氧化磷酸化功能的改變，可引起細胞的能量代謝障礙，組織器官功能減退，成為生物體衰老的一個重要因素。mtDNA突變主要包括點突變、缺失突變和DNA重排，其中DNA片段的缺失與衰老的關系非常密切，且缺失存在于個體心肌、腦、肝、腎等多種組織中[3-5]。曾昭惠[3]等對小鼠大腦及鼠毛組織mtDNA 3867bp片段缺失的研究證明，老年鼠mtDNA存在該片段的缺失，中青年鼠則無缺失現象。盧健[8]等報道20月齡小鼠心肌mtDNA 3 867 bp的缺失較5月齡小鼠高。由此，許多研究表明，小鼠mtDNA 3 867 bp片段缺失已成為衰老生物學的標志之一。

D-半乳糖衰老模型是國內外公認的衰老造模方法，受到自由基、活性氧等衰老理論的支持。許多學者的研究均已證實，D-半乳糖衰老模型出現多種與自然衰老類似的生化改變，在生物體內出現多系統、多組織、多水平的變化［9］。本研究中衰老模型組mtDNA缺失程度與空白對照組具有顯著差別，提示該實驗造模成功。

還少丹源于《濟陽綱目》，該方具有益精補髓，壯元陽，延年益壽，白發變黑的功效，是中醫古籍中記載的補腎抗衰名方。近年來已有研究報道，該方能加快機體內自由基的清除，提高細胞抗氧化的能力，延緩小鼠端粒長度的縮短[10-11]。本研究證明，還少丹能有效地降低D-半乳糖誘導的衰老模型小鼠心肌mtDNA 3 867 bp片段的缺失率，提示該方能降低心肌mtDNA的氧化損傷，保護心肌mtDNA的結構完整性，從分子水平上論證了補腎抗衰的作用機制。

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（本文編輯 彭芝配）

Effect of Huanshaodan on deletion of myocardial mitochondrial DNA induced by D-gal in aged mice

CHENG Li-juan,LIU Qun-liang,TAN Feng,HU Mei,ZHOPU Sai-nan
（TCM Univerity of Hunan,Changsha,Hunan 410208,China）

Objective To investigate the effect of Huanshaodan on deletionof myocardial mitochondrial DNA induced by D -gal in aged mice. Methods Forty micewere divided randomly into blank control group, aged model group, low dose groupand high dose group. The models were established by injecting D-gal and feed with distilledwater and Huanshaodan decoction respectively 6 weeks. The polymerase chain reaction(PCR) wasused to amplified the myocardial mitochondrial DNA. The agarose gel electrophoresis andlight density scanning were used respectively to detect the products of PCR and ratioof mtDNA deletion. Results The mtDNA deletion products were not in bland control group butin all other groups in some degrees. Compared with model group, the mtDNA deletion inboth dose groups were significant (P<0.05)but difference between the low dose groupand high dose group not obvious (P>0.05). Conclusions Huanshaodan can reduce the mtDNA deletion in aged mice,which suggests that the drugcan reduce the oxida-tive damage of mt DNA and protect mt DNA perfection,provides a experimental evidence for the study of anti-aging mechanism of Chinese medicine in molecular level.

Huanshaodan； senile； myocardial； mtDNA;mice;multi flower knotweed;prepared rhizome of rehmannia;Cistanche salsa

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2011.05.006.020.03

2011－03－16

湖南省教育廳資助項目（07C479）。

程莉娟（1979-），女，湖南津市人，講師，主要從事中藥抗衰老的分子機制研究。

* 劉群良，女，教授，E-mail:liuqunliang2000@yahoo.com.cn。