基于核酸適配體－熒光染料EvaGreenTM快速檢測ATP的研究

陳伶利 ，李 杰 ，賀氣志 ，陳 輝 ，毛平道 ，鄧 樂 *

（1.湖南師范大學生命科學學院，湖南 長沙 410081；2.湖南中醫藥大學基礎醫學院，湖南 長沙 410208）

基于核酸適配體－熒光染料EvaGreenTM快速檢測ATP的研究

陳伶利1,2，李 杰2，賀氣志1，陳 輝1，毛平道1，鄧 樂1*

（1.湖南師范大學生命科學學院，湖南 長沙 410081；2.湖南中醫藥大學基礎醫學院，湖南 長沙 410208）

目的 利用熒光嵌入染料EvaGreenTM在單雙鏈DNA溶液中不同的熒光性質構建基于核酸適配體的ATP檢測體系，建立一種簡單、高效的檢測ATP的新方法。方法 利用ATP核酸適配體雙鏈DNA（dsDNA）和核酸綠色熒光染料Eva GreenTM嵌合作用，實現了對ATP的檢測?？疾炝薃TP的孵育溫度、pH、濃度等因素對熒光強度的影響,并對該方法的特異性進行了驗證。結果 反應體系在12℃，pH 7.5條件下具有最佳實驗效果，在最優條件下，最低能檢測10-6mol/L的ATP，并具有較高的特異性。結論 本研究為ATP的快速檢測提供了一種易于操作、低成本的新方法。

核酸適配體；EvaGreenTM；ATP；檢測

腺嘌呤核苷三磷酸 (adenosine-triphosphate,ATP)在生物體與外界進行物質和能量交換的過程中，起著重要的橋梁、紐帶作用，它是生物體各種生命活動能量的直接來源，因此在很多的生物反應檢測中ATP是一項重要的檢測內容[1-2]。目前，檢測ATP的方法主要有電泳法、光學分析法、層析法、生物發光法(熒光素酶法)等，但是以上方法操作復雜、費時，且靈敏度不高；2009年 Li W等人提出用金納米粒子來檢測ATP，可以檢測到1～10mmol/L的ATP，大大提高了檢測靈敏度，但此方法需要制備特異的核酸修飾的金納米探針，檢測成本較高[3]。Huizenga和 Szostak于1995年通過SELEX技術篩選出ATP/Adenosine適配體[4]，基于適配體技術的檢測研究受到了極大的關注[5-7]。2008年Zhang Chen等將量子點標記的適配體生物傳感器用于ATP檢測[8]，2009年孫波等用高靈敏適配體電化學發光生物傳感器來檢測血樣中的ATP[9]，但是這些方法需要使用特殊試劑，分析成本較高。染料Eva GreenTM是一種綠色熒光核酸染料，它有良好的熱穩定性和水解穩定性，為常規操作提供了便利，而Eva GreenTM本身沒有熒光，與dsDNA嵌合后能發出高亮度的熒光，但當dsDNA轉化為ssDNA后熒光強度將大大減弱。與熒光核酸染料SYBRTM GreenⅠ相比，E-va GreenTM可以在更高濃度下使用，從而產生更強的擴增信號[10-12]。

本研究以ATP為目標分析物，以核酸適配體-ATP的特異性識別與dsDNA與熒光染料Eva GreenTM的嵌合作用為基礎，發展了一種簡單、靈敏的熒光檢測新技術。由于Eva GreenTM與dsDNA嵌合后能發出高亮度的熒光，但與ssDNA結合后熒光強度大大減弱。利用核酸適配體-ATP復合物的形成所引起的熒光值變化來檢測ATP。實驗結果表明，本方法操作簡單，不需要對樣品進行處理，檢測所需時間短，整個檢測過程可以在40min內完成。同時具有較高的靈敏性、較強的特異性，最低檢測下限為10～6 M;該方法的建立為ATP的分析檢測提供了新的技術支持?，F將方法與結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 LS50B型熒光分光光度計（PerkinElmer，美國）。

1.1.2 試劑 染料Eva GreenTM購自北京美萊博醫學有限公司 （Biotium，美國，20×），使用時稀釋20倍；ATP、GTP、CTP、UTP購自上海生物工程技術服務公司（BBI公司）；實驗用水均為超純水；緩沖液為0.01moL/L 磷酸緩沖液 （PBS，pH 6.0～8.0）， 均為115℃滅菌20min，冷卻后備用；所有序列（表1）均由上海生工生物工程技術服務公司合成，PAGE純化。

表1 ATP核酸適配體序列表

1.2 實驗原理

本實驗的分子識別與檢測原理如圖1所示：利用熒光嵌入染料EvaGreenTM在單雙鏈DNA溶液中不同的熒光性質構建了基于核酸適配體的ATP檢測體系。由于綠色熒光染料Eva GreenTM與dsDNA的嵌合作用，系統產生較強的熒光信號。當dsDNA與ATP孵育后，ATP能識別其特異適配體，并形成適配體－ATP復合物，使DNA雙鏈解鏈，嵌合的熒光染料Eva GreenTM得以釋放，從而導致系統熒光信號驟然減弱，通過檢測系統熒光信號變化強度可定量測定ATP的濃度。

圖1 核酸適配體-ATP復合物熒光信號傳感技術原理示意圖

1.3 方法

1.3.1 dsDNA制備 取10μmol的ATP核酸適配體溶液與10μmol/L的互補序列等量混和，4℃過夜，即得10μmol/L的含ATP適配體的dsDNA。

1.3.2 適配體與ATP相互作用 取10μmol的dsDNA 5 μL于1.5 mL EP管中，再分別加入0.01moL/L PBS（pH 7.5）589 μL，不同濃度 ATP 6 μL，對照管以等體積PBS代替ATP。于12℃孵育1 h。

1.3.3 熒光值的檢測 分別取與ATP孵育后的溶液及對照管溶液各197.5 μL，并加入 2.5 μL Eva GreenTM，振蕩10min后在熒光分光光度計上分別測其熒光值，調激發波長為490 nm，發射波長為525 nm。實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 孵育溫度對于熒光強度的影響

反應溫度對適配體與ATP的結合能產生一定的影響。將dsDNA與ATP反應體系置于不同溫度下反應，檢測熒光信號變化值，確定該反應的最佳孵育溫度。室溫（約12℃）為最佳的孵育溫度。溫度較低或較高時，dsDNA的解鏈不完全，與其嵌合的熒光染料Eva GreenTM釋放量少，從而檢測到的熒光信號變化不顯著，見圖2。

2.2 不同pH值對于熒光強度的影響

圖2 孵育溫度對熒光影響強度的柱形分析圖

在反應體系中，不同的pH值的PBS緩沖液對熒光強度的檢測也具有顯著的影響。在空白熒光為489.38 的條件下，pH 6.0、 6.5、 6.8、 7.0、 7.3、7.5、8.0所測得的熒光值分別為 358.02、288.04、276.34、266.83、236.64、183.26、226.04 au,實驗重復 3 次，取平均值。該結果表明：pH值為7.5時，反應檢測所得的熒光強度最低，即熒光變化值最大，說明在pH 7.5時，緩沖液對反應體系的影響最小。這是因為熒光強度的變化決定于Eva GreenTM的釋放量，而Eva GreenTM的釋放量又受適配體－ATP結合程度的影響，而pH值能夠影響適配體－ATP復合物的解離，在pH 7.5時，適配體－ATP復合物的解離程度最小，因此該pH是本反應體系的最適值，見圖3。

圖3 pH值對熒光強度檢測影響的散點分析圖

2.3 線性范圍及檢出下限

考察了ATP的濃度對于反應體系熒光信號檢測的影響。在空白熒光為489.38，背景信號為13.57的條件下，隨著ATP濃度的減小，所測得的熒光信號與空白對照的變化值越來越小，當ATP濃度為10-7mol/L時，所測結果與10-6mol/L變化很小，趨近為零，說明對10-7mol/L的檢測無意義，見圖4。

2.4 ATP特異性檢測

圖4 ATP濃度對于熒光強度影響的散點分析圖

為了檢驗本體系對ATP檢測的特異性，實驗還考察了不同濃度的其他同類型NTP分子，即CTP、GTP、UTP分子。將NTP分子與實驗所用的核酸適配體在相同條件下反應，并檢測它們的熒光信號變化值。實驗測得dsDNA的起始熒光強度為481。通過4組不同濃度NTP分子檢測結果的對比，隨著濃度的變化，對照組CTP、GTP、UTP的熒光信號有緩慢上升的趨勢，但變化不明顯。這是因為CTP、GTP、UTP在結構上與ATP存在一定的相似性，能與ATP適配體存在一定程度的結合，因而釋放出少量的染料，使熒光信號出現少量變化。而在實驗組隨著ATP濃度的減小，熒光強度有明顯增大，也就是說隨著ATP濃度的減小，熒光信號變化值也變小。以上結果說明本實驗建立的熒光傳感技術對于ATP分子檢測具有較高的特異性，見圖5。

圖5 ATP特異性檢測折線圖

3 討論

本研究基于核酸適配體-ATP復合物與綠色熒光染料Eva GreenTM作用，建立了熒光信號檢測技術的新方法。

本研究優化了核酸適配體與ATP結合反應的實驗條件。實驗結果可知，核酸適配體與ATP反應的最適溫度為12℃；pH值為7.5時，熒光檢測結果最靈敏；在最優化的實驗條件下，隨著ATP濃度的減小，所測得的熒光信號與空白對照的變化值變小，當 ATP 濃度從 10－6mol/L 到 10－2mol/L 變化，對應的熒光強度隨著濃度的減小而增大，呈現一定的線性關系。因此可作為該范圍濃度的ATP檢測新方法。體系還對該方法的特異性作出了探討，采用與ATP同類型分子CTP、GTP、UTP作為對照，根據檢測出的結果證實該核酸適配體對與ATP分子的檢測具有較強的特異性。

本研究所建立的基于核基于核酸適配體-ATP特異識別的熒光傳感技術，對于ATP分子的檢測相較于其他的檢測方法，不僅反應體系特異性高，并且實驗操作簡單，耗時少，成本低?？梢姡狙芯繛橹蟮姆肿幼R別檢測提供了更為堅實的基礎。

[1] Bell PD,Komlosi P,Zhang ZR. ATP as a mediator of macula densa cell signalling[J].Purinergic Signal,2009,5(4):461-471.

[2]Minikh O,Tolba M,Brovko LY,Griffiths MW.Bacteriophagebased biosorbents coupled with bioluminescent ATP assay for rapid concentration and detection of Escherichia coli[J].J Microbiol Methods,2010，82(2):177-183.

[3]Li W,Nie Z,Xu X,Shen Q,Deng C,Chen J,Yao S.A sensitive,label free electrochemical aptasensor for ATP detection[J].Talanta,2009,78(3):954-958.

[4]Huizenga D E and Szostak J W.A DNA aptamer that binds adenosine and ATP[J].Biochemistry,1995,（34）:656-665.

[5]Huang H,Tan Y,Shi J,Liang G,Zhu JJ.DNA aptasensor for the detection of ATP based on quantum dots electrochemiluminescence[J].Nanoscale,2010，2(4):606-612.

[6]Liu G,Mao X,Phillips JA,Xu H,Tan W,Zeng L.，Aptamernanoparticle strip biosensor for sensitive detection of cancer cells[J].Anal Chem，2009，81(24):10013-10018.

[7] Xie S, Walton SP.Development of a dual-aptamerbased multiplex protein biosensor[J].Biosens Bioelectron，2010，25(12):2663-2668.

[8]Zhang Chen, Guang L，Le Deng.new method for the detection of ATP using quantum-dot-tagged aptamer[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry,2008,392(6):1185-1188.

[9]孫 波，楊 娜，楊玉華.高靈敏適配體電化學發光生物傳感器檢測血樣中的 ATP[J].分析化學，2009，（37），256.

[10]Chen Y,Wu Y,Wang J,Xu B,Zhong Z,Xia J.Identification ofcervidae DNA in feedstuff using a real-time polymerase chain reaction method with the new fluorescence intercalating dye EvaGreen[J].J AOAC Int.,2009,92(1):175-180.

[11]Qian Z,Lin J,Qian J,Yao D,Wang Y,Han L,Zhu Z,Xiao G.Quantification of GRAF gene expression in patients with acute myeloid leukemia using EvaGreen real time quantitative PCR[J].zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi,2010,27(3):290-293.

[12]Ihrig J,Lill R,Mühlenhoff U.Application of the DNA-specific dye EvaGreen for the routine quantification of DNA in microplates[J].Anal Biochem,2006,359(2):265-267.

Study of rapid detecting ATP based on aptamer and DNA-specific dye EvaGreenTM

CHEN Ling-li,LI Jie,HE Qi-zhi,CHEN Hui,MAO Ping-dao1,DENG Le
(College of Life Science,Hunan Normal University,Changsha,Hunan 410081,China)

Aptamer;Eva GreenTM;ATP;detection

Q-331

B

10.3969/j.issn.1674－070X.2011.05.002.006.04

〔Absrract〕Objective To develop a simple,efficient fluorescence detection technology for ATP.Methods The DNA-intercalating dye Eva GreenTMaptamer-ATP complex was used to detect quickly ATP.The effects of temperature,concentration,pH and reaction time were studied.Results The reacting system was that the best temperature and pH were 12℃and pH7.5,The ATP at limitation 10～6moL/L was detected with optimized conditions.Conclusion This research provides a kind of easy operation and low cost method for ATP rapid detection.

2011－01－06

國家科技部863計劃資助項目（2007AA062Z403）。

陳伶利（1979－），女，湖南株洲人，博士，主要從事病原微生物檢測技術研究。

*鄧 樂，男，教授，博士研究生導師，E-mail：dengle@hunnu.edu.cn。

（本文編輯 彭芝配）