腦脊液中檢測DLL1對結(jié)核性腦膜炎的診斷意義

沈 萍 魯晶晶 李盡義 彭 濤 賈延劼△

1)河南新鄭市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 新鄭 451100 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052

腦脊液中檢測DLL1對結(jié)核性腦膜炎的診斷意義

沈 萍1)魯晶晶2)李盡義2)彭 濤2)賈延劼2)△

1)河南新鄭市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 新鄭 451100 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052

目的探索腦脊液(CSF)中Delta-like-1(DLL1)的檢測在結(jié)核性腦膜炎診斷中的臨床價值。方法選擇診斷明確的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病患者50例,分為結(jié)核性腦膜炎(結(jié)腦組)30例,病毒性腦(膜)炎(病腦組)20例,以及正常對照組20例,顱內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤(腫瘤組)8例。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)定量測定患者CSF中DLL1的含量。結(jié)果各組CSF中DLL1的含量,結(jié)腦組顯著高于其他組別,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01),其他組別之間相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。各組CSF中DLL1的含量與CSF蛋白、細(xì)胞數(shù)、葡萄糖、氯化物及顱內(nèi)壓均無相關(guān)性。結(jié)論DLL1檢測作為一種新的指標(biāo),在結(jié)核性腦膜炎的診斷中可能有重要臨床價值。

Delta-like-1;結(jié)核性腦膜炎;腦脊液

近年來,由于耐藥結(jié)核菌株增加、人口流動及獲得性免疫缺陷綜合征流行等因素,結(jié)核性腦膜炎(tuberculousmeningitis,TBM)發(fā)病率明顯上升,成為威脅人類生命的主要肺外結(jié)核病。對結(jié)核性腦膜炎患者進(jìn)行早期診斷,及時治療,是挽救生命,減少后遺癥的關(guān)鍵[1]。鑒于臨床工作中結(jié)核性腦膜炎不典型病例增多,常規(guī)的實(shí)驗(yàn)方法敏感性低等狀況,尋找一種簡單易行有助于臨床診斷的生物標(biāo)記物顯得尤為重要。脂肪酸代謝是結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tubercu-losis)存活的重要碳源。近年來研究發(fā)現(xiàn),脂肪酸代謝還與結(jié)核分枝桿菌的毒力和逃逸免疫系統(tǒng)攻擊的能力息息相關(guān)[2]。基于這種理論,本研究選擇了一個參與脂肪代謝調(diào)節(jié)的指標(biāo)——Delta-Like-1(DLL1)[3],采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA法)定量測定中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病患者CSF中DLL1的含量,探討DLL1檢測在結(jié)核性腦膜炎診斷中的意義。

1 資料和方法

1.1 研究對象 選取2007-09～2010-09入住新鄭市人民醫(yī)院和鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科及兒科的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病患者50例,均嚴(yán)格按照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)確診。結(jié)核性腦膜炎患者30例為結(jié)腦組,男10例,女20例,年齡7～49歲,平均(19.2±14.0)歲;病毒性腦(膜)炎患者20例為病腦組,男12例,女8例,年齡6～ 53歲,平均(15.9±11.8)歲;正常對照組選擇無中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、腫瘤、免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾病而需要鑒別診斷的周圍神經(jīng)病變或頭痛等患者20例,男 13例,女 7例,年齡 4～ 60歲,平均(22.2±17.4)歲。同時選擇顱內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤8例為腫瘤組,男6例,女2例,年齡 39～70歲,平均(55.3±7.4)歲。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) (1)年齡＞12周歲的24例患者按照Ahuja等[4]的TMB診斷標(biāo)準(zhǔn)(Ahuja標(biāo)準(zhǔn))。(2)年齡≤12周歲的6例患者參照有 Seth和 Sharma[5]的標(biāo)準(zhǔn)(Seth標(biāo)準(zhǔn))。

1.3 研究方法

1.3.1 標(biāo)本采集：在獲得患者或其家屬知情同意的情況下,行腰穿取腦脊液2 m L。所有標(biāo)本登記后,均放入-20℃冰箱保存。

1.3.2 DLL1的測定：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA法),試劑盒由韓國AdipoGen公司提供,貨號：AG-45A-0027EKKI01,嚴(yán)格按照說明書操作。(1)準(zhǔn)備好試劑及樣品后,從密封的鋁箔袋取出適當(dāng)數(shù)量的微孔條。(2)吸100μL標(biāo)準(zhǔn)樣品(#0～#7),重組質(zhì)量控制樣品和稀釋的樣品加入抗體涂層板,每次換個新的吸頭。(3)37℃孵育1 h。(4)棄去溶液,對每口孔用300μL洗滌液沖洗3次。(5)向每口孔添加100 μL二抗。(6)37℃孵育1 h。(7)棄去溶液,用300μL洗滌液沖洗3次。(8)向每口孔添加100μL顯色底物。(9)37℃孵育1 h。(10)棄去溶液,用 300μL洗滌液沖洗5次。(11)加入100μL顯色液至每口孔。(12)避光下在室溫下孵育20 min。(13)向每口孔添加100μL終止液。(14)在 450 nm 處讀取。(15)減去從每個標(biāo)準(zhǔn)和樣品吸光度閱讀空白。(16)構(gòu)建一個通過繪制已知濃度(濃度)(Y)與吸光度(吸光率)(X)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖1示,一個可衡量的范圍通常為(標(biāo)準(zhǔn)曲線)0.125～8 ng/m L。(17)通過回歸曲線插值公式,計算樣品的可溶性DLL1濃度,如下所示的一個二次方程公式：Y=8.973X2+5.7289X-0.0474;R2=0.9996。(18)DLL1濃度計算乘以稀釋倍數(shù),以獲得該樣品稀釋前的濃度。

檢測CSF常規(guī)、生化、細(xì)胞學(xué)、病毒學(xué)、腺苷脫氨酶、抗結(jié)核抗體、抗酸染色、墨汁染色、腫瘤標(biāo)記物、細(xì)菌培養(yǎng)等相關(guān)指標(biāo)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間比較用方差分析(F檢驗(yàn))或K ruskal-Wallis檢驗(yàn),組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)、Bonferroni法或 Tamhane's T2法;2組間比較用t檢驗(yàn)或W ilcoxon秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CSF中DLL1的含量測定 表1示,結(jié)腦組、病腦組、對照組、腫瘤組CSF中DLL1的含量(ng/m L)分別為3.41±3.04、0.23±0.26、0.22±0.22、0.37±0.37,結(jié)腦組與病腦組、對照組、腫瘤組相比均有極顯著性差異(F=18.217,P=0.000＜0.01),病腦組、腫瘤組與對照組相比均無顯著性差異(F=1.045,P=0.132＞0.05)。

表1 各組CSF中DLL1的含量比較 (±s)

表1 各組CSF中DLL1的含量比較 (±s)

注：P值為結(jié)腦與其他組別相比

組別 n DLL1(ng/m L)DLL1＞1.0 ng/m L[例(%)]P值結(jié)腦組 30 3.41±3.04 26(86.7)病腦組 20 0.23±0.26 0 0.000對照組 20 0.22±0.22 0 0.000腫瘤組 8 0.37±0.37 1(12.5) 0.000

2.2 DLL1的含量與CSF中蛋白、細(xì)胞數(shù)、葡萄糖、氯化物及顱內(nèi)壓的相關(guān)性 CSF中DLL1的含量與蛋白含量、細(xì)胞數(shù)、葡萄糖、氯化物及顱內(nèi)壓均無相關(guān)性。

3 討論

結(jié)核性腦膜炎病人的臨床表現(xiàn)漸趨于不典型,以至于臨床診斷不明確而延誤病情。傳統(tǒng)的涂片抗酸染色敏感率低;結(jié)核分支桿菌培養(yǎng)不但敏感率低,耗時也長;聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)不斷改進(jìn),敏感度和特異度可達(dá)87.6%和92.0%[6],但技術(shù)條件要求越來越高。確診困難、誤診率和漏診率高是當(dāng)前我國結(jié)核性腦膜炎的臨床現(xiàn)狀。應(yīng)用免疫學(xué)方法檢測腦脊液中的特異性生物標(biāo)記,有望彌補(bǔ)上述方法的種種缺陷。

基因組分析可知,結(jié)核分枝桿菌基因組含4000多個基因,其中有250個基因編碼脂肪酸代謝相關(guān)的酶,和大腸桿菌相比多了4倍有余。結(jié)核桿菌的細(xì)胞壁以肽聚糖為基本架構(gòu),共價結(jié)合阿拉伯半乳糖及分支菌酸。分支菌酸是自然界中最大的脂肪酸,它和結(jié)核桿菌的毒力、結(jié)核桿菌逃逸免疫系統(tǒng)攻擊的能力息息相關(guān);另外,細(xì)胞壁所含的脂類約占細(xì)胞壁干質(zhì)量的60%,這些證據(jù)均說明了脂肪代謝對結(jié)核桿菌的重要性[2]。

DLL1是果蠅Notch的5種配體之一,是737個氨基酸組成的L型跨膜蛋白,其胞外段中有1個DSL基序和8個EGF樣結(jié)構(gòu)域;Notch配體與受體的相互作用通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo),精確地調(diào)控各譜系細(xì)胞的分化,決定細(xì)胞的命運(yùn),對細(xì)胞的增殖和凋亡也有廣泛的調(diào)控作用[3]。研究報道,Notch1信號可以通過調(diào)控脂肪酸活化的轉(zhuǎn)錄因子影響脂肪細(xì)胞的形成,在脂肪代謝中起到重要作用[7]。結(jié)核病是一種慢性消耗性疾病,存在脂肪代謝的紊亂,導(dǎo)致脂肪細(xì)胞過度分化;Notch配體DLL1的加速脫落可能有助于Notch信號促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化。因此,本研究采用ELISA法定量測定中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病患者CSF中DLL1的含量,尋求新的結(jié)核性腦膜炎診斷方法。

結(jié)果表明,結(jié)核性腦膜炎組中CSF的DLL1含量明顯高于其他組別,30例測定值中26例(86.7%)＞1.0 ng/m L,而病腦和正常對照組無1例＞1.0 ng/m L,以大于該值為判斷值,就可以很好地與病腦及正常人區(qū)別開來,且 CSF中DLL1的含量與CSF中蛋白、細(xì)胞數(shù)、葡萄糖、氯化物及顱內(nèi)壓均無相關(guān)性,對不典型病例有更大的診斷價值。這種現(xiàn)象的機(jī)制尚不完全清楚,除了與前述的DLL1過多脫落有助于Notch信號促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化有關(guān)之外,還可能涉及如下的機(jī)制：(1)當(dāng)結(jié)核菌侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)后引起結(jié)核性腦膜炎時,因局部的免疫反應(yīng),使T淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯增多、增殖、分化,T淋巴細(xì)胞釋放出炎性因子、淋巴細(xì)胞毒素等,從而出現(xiàn)滲出、炎癥;T淋巴細(xì)胞增多需要Notch信號途徑的激活,Kapoor等發(fā)現(xiàn)在結(jié)核性腦膜炎患者腦內(nèi)結(jié)核性肉芽腫中Notch1信號途徑的激活。Notch信號通路在造血干細(xì)胞向T細(xì)胞分化過程中至關(guān)重要,如果缺少Notch受體蛋白,胸腺中的淋巴祖細(xì)胞只發(fā)育成B細(xì)胞,無T細(xì)胞的產(chǎn)生[8],在外周Notch信號途徑的激活可以使淋巴樣前體細(xì)胞向T細(xì)胞譜系而不向B細(xì)胞譜系發(fā)育;細(xì)胞亞群中ADAM介導(dǎo)的DLL1脫落,似乎有助于Notch信號在鄰近細(xì)胞的下調(diào),并促進(jìn)淋巴祖細(xì)胞的分化進(jìn)程,促進(jìn)T細(xì)胞的產(chǎn)生。(2)DLL1通過支架蛋白MAGI1,位于神經(jīng)細(xì)胞突起的黏附連接(adherens junctions,AJs)里,當(dāng)結(jié)核性腦膜炎導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞黏附連接損傷后,DLL1可能釋放出來,從而使得DLL1的含量增高[9]。

綜上所述,結(jié)核性腦膜炎患者CSF中DLL1含量明顯增高,而病腦與正常對照組CSF中DLL1的含量很低或基本測不到;顱內(nèi)腫瘤組CSF中DLL1的含量偏低。檢測CSF中DLL1的含量對于結(jié)核性腦膜炎的診斷和鑒別診斷具有重要參考意義。

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Significance of detecting DLL1 in cerebrospinal fluid on diagnosing tuberculousmeningitis

Shen Ping,Lu Jing jing,Li Jinyi,eta l.Departmentof Neurolog y,the Peop le's Hospita l of X inzheng City,X inzheng451100,China

ObjectiveTo investigate clinical value ofmeasurementof the cerebrospinal fluid DLL1 in diagnosis of tuberculousmeningitis.MethodsFifty patientswith central nervous system in fects of exp licit diagnosisw ere divided into two groups,group TM included 30 tuberculousmeningitis sick patients,group VM included 20 viralmeningitis cases,compared w ith 20 controls with no central nervous system infection,and group IMT included 8 intracranialmetastatic tumors patients.So luble DLL1 in CSF of these patientsw ere synchronal detected by ELISA.ResultsThe levels of CSF solub le DLL1 in TM wereobviously higher than those of VM and controlgroup and IM T(3.41±3.04 vs 0.23±0.26,0.22±0.22,0.37±0.37,P＜0.01),there were no significant differences among VM,PM,IM T and controls(P＞0.05).The levels of CSF so lub le DLL1 w ere not relevantw ith CSF protein,CSF cell count,CSF g lucose,CSF ch loride and intrac ranial p ressure in all the groups.ConclusionMeasurement of soluble DLL1 as a novel indication,possibly has potential important clinical value in the tubercularmeningitis diagnosis.

DLL1;Tuberculousmeningitis;Cerebrospinal fluid

R529.3

A

1673-5110(2011)09-0014-03

△通訊作者：賈延劼,E-mail：jiayanjie1971@yahoo.com.cn

(收稿2011-03-26)