多形性膠質母細胞瘤放射前后ATM蛋白的表達及ATM/PI3-K區突變檢測

陶勝忠 尹先印 牛光明 張鵬遠

鄭州大學第二附屬醫院神經外科 鄭州 450014

多形性膠質母細胞瘤放射前后ATM蛋白的表達及ATM/PI3-K區突變檢測

陶勝忠 尹先印 牛光明 張鵬遠

鄭州大學第二附屬醫院神經外科 鄭州 450014

目的探討多形性膠質母細胞瘤(GBM)細胞輻射前后ATM蛋白表達量的變化及ATM/PI3-K區基因突變的情況。方法采用流式細胞儀技術檢測U251細胞系及5例原代培養的多形性膠質母細胞瘤細胞以2 Gy射線劑量照射前后ATM蛋白表達量的變化,以逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)技術和PCR產物直接測序方法,對多形性膠質母細胞瘤細胞中ATM/PI3-K區關鍵區域進行突變檢測。結果U 251細胞系中60Co照射前后ATM蛋白量均明顯低于原代培養GBM的ATM蛋白量,U 251和原代GBM細胞ATM蛋白表達量有顯著差異(P＜0.05);U 251細胞系及原代培養GBM細胞60Co照射后的ATM表達雖有所升高,但經統計學分析無顯著性差異(P＞0.05)。所測U 251細胞系及5例原代培養的多形性膠質母細胞瘤細胞中ATM/PI3-K區序列中未檢測到基因突變。結論ATM蛋白表達水平不能完全反映ATM蛋白激酶的活性,多形性膠質母細胞瘤的放射抗拒可能與ATM/PI3-K區基因突變不相關。

多形性膠質母細胞瘤;A TM蛋白;A TM/PI3-K

多形性膠質母細胞瘤(gliob lastomamu ltiforme,GBM)是腦膠質瘤中惡性程度極高的一類腫瘤,手術難以全切,術后易復發且對放射治療不敏感,預后不良。GBM對放射抗拒的機制尚不清楚。研究表明[1-2],ATM(ataxia telangiectasiamutated,ATM)基因是對電離輻射高度敏感的共濟失調毛細血管擴張癥的唯一致病基因,其 PI3-K(phosphatidylinositol-3-kinase)功能區的突變會引起細胞放射敏感性的改變。為探討GBM對放射治療抗拒的原因,我們采用流式細胞儀技術檢測了U 251細胞系和5例原發GBM60Co照射前后ATM蛋白量的變化,并采用RT-PCR和PCR產物直接測序方法,對其ATM/PI3-K關鍵區域進行了突變檢測。

1 材料與方法

1.1 研究對象及主要儀器 多形性膠質母細胞瘤細胞系U 251由武漢大學典型物保藏中心提供。5例原發多形性膠質母細胞瘤均經常規病理學檢查證實。

1.2 細胞培養及照射 U251細胞系及5例GBM采用RPM I-1640培養基,pH值7.4,含10%小牛血清,青鏈霉素各100 IU/m L,處于指數生長的貼壁細胞用0.25%的胰蛋白酶消化后傳代,細胞密度為1×106/m L接種于培養瓶中,置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中孵育過夜,用60Co治療機以2Gy放射劑量進行照射,并于照射后4 h、24 h收取細胞。照射前后細胞以75%冰乙醇固定,至于-80℃冰箱待用。

1.3 流式細胞儀檢測60Co照射前后ATM蛋白表達量ATM鼠抗人單克隆抗體購自晶美生物有限公司,FITC標記山羊抗小鼠IgG及Triton、BSA等試劑購自武漢凌飛科技有限公司。應用FACSort流式細胞儀進行檢測,以488 nm激光激發,應用Mod LTFit 2.0軟件進行ATM蛋白表達含量的分析。設立用PBS代替一抗的陰性對照及正常對照。

1.4 半定量逆轉錄多聚酶鏈式反應(RT-PCR)及產物序列分析 根據Genbank Database中ATM基因mRNA序列,應用PRIMER 5.0設計軟件設計一對針對A TM主要功能區PI3-K區的引物。引物序列為：上游引物5'-CAGTGCCTTTCAGTGCCAAA-3',下游引物 5'-GTTTCATCTTCCGGCCTCTG-3',擴增產物為546 bp,內參照為β-action。引物及內參均由上海博亞生物技術公司合成。PCR產物序列分析由上海博亞生物技術公司完成。

2 結果

2.160Co照射前后ATM 蛋白表達量 U 251細胞系中60Co照射前后ATM 蛋白量均明顯低于原代培養GBM的ATM 蛋白量(P＜0.05)。U251細胞系及原代培養GBM細胞60Co照射后的ATM 蛋白表達水平雖有所升高,但經統計學分析無顯著性差異(P＞0.05)。

表1 U 251細胞系和原代培養GBM放射前后的ATM平均蛋白熒光強度

2.2 ATM mRNA表達量 紫外分光光度儀測定mRNA純度：A 260/280∶1.8～2,提取的 mRNA經 RT-PCR后出現特異性的DNA條帶。U251和原代GBM細胞ATM半定量RT-PCR產物電泳結果：其ATM m RNA相對表達量分別為0.327±0.047和0.758±0.091,經統計學分析,U251和原代GBM細胞ATM m RNA表達量有顯著差異(P＜0.05)。

2.3 DNA序列分析 PCR產物經正反序列分析,結果與基因庫中ATM序列完全一致。

3 討論

ATM蛋白是輻射反應金字塔的中樞成分之一,可以早期感知輻射所致損害和啟動檢測點信號的功能,激活的ATM蛋白觸發其下游通路并調節包括細胞周期阻滯、DNA修復和轉錄調節等特異的生化和細胞反應。ATM蛋白激酶是ATM蛋白的活性形式,該激酶與DNA輻射損傷后修復緊密關聯,其活性改變引起DNA修復進程的中斷可能是導致放射高敏感性的重要原因[3]。一旦暴露于離子射線,ATM蛋白激酶活性可被立刻激活,并導致許多涉及DNA修復、凋亡及細胞周期阻滯的關鍵靶基因的磷酸化作用[4]。

為此,我們采用流式細胞技術分別檢測了來源于膠質母細胞瘤的U 251細胞系和5例原發多形性膠質母細胞瘤60Co照射前后ATM蛋白量的變化以期了解輻射對ATM蛋白表達水平的影響。結果發現,U 251細胞系中60Co照射前后ATM蛋白量均明顯低于原代培養GBM的ATM蛋白量,多形性膠質母細胞瘤細胞在遭受2 Gy放射劑量照射后,ATM蛋白表達水平雖有所升高,但與照射前相比差異無統計學意義(P＜0.05)。文獻報道,遭受輻射后ATM表達水平并未改變,但激酶活性卻可增加數倍[3]。對正常人淋巴細胞進行細胞周期各時相特異的ATM激活 TP53-15絲氨酸磷酸化的研究顯示,ATM蛋白激酶活性在細胞受電離輻射后立即上升,但和ATM蛋白量變化并不一致[15]。因而,我們認為ATM蛋白表達水平并不能完全反映其激酶活性,目前尚不清楚ATM如何被激活,可能與輻射后ATM的磷酸化及構象改變修飾染色質結構有關。

已建系的膠質瘤細胞在生物學特性上與體內的腫瘤細胞有較大差異,原代培養的細胞則不同,由于細胞剛剛離體,生物學特性未發生很大變化,仍具有腫瘤細胞的遺傳物性,很接近體內的生長特性,即使組織類型、部位相同,個體差別也可以在培養的細胞上反映出來[4]。我們的結果顯示了U 251細胞系和原代培養多形性膠質母細胞瘤ATM蛋白表達水平的差異(P＜0.05)。

到目前為止,已經發現了上百種ATM基因的突變類型,這些突變分布于ATM基因全長序列中,其中絕大多數突變表現為整個ATM基因的截短或大片斷缺失,從而導致其表達產物失活[6]。PI3-K片斷是ATM基因mRNA編碼ATM蛋白關鍵活性區域的序列,抑制該區域蛋白翻譯可以滅活ATM的功能。在放射等細胞DNA損傷條件下,ATM的PI3-K可作為細胞的生存因子降低細胞對放射線及類射線細胞毒藥物的敏感性[7]。我們結合文獻選擇了作為ATM基因mRNA編碼ATM蛋白PI3-K區關鍵區域序列(8578～9123 nt,546 bp)為靶點,應用反轉錄聚合酶鏈式反應方法獲得ATM/PI3-K區域編碼序列的cDNA片段,并對PCR產物進行直接測序。結果表明,在 U 251細胞株和原代培養的GBM細胞中,均未發現ATM/PI3-K區域的序列性突變。但由于ATM基因編碼序列有12 kb,其中PI3-K區全長為1.2 kb[8],本實驗僅檢測了ATM基因m RNA編碼ATM蛋白PI3-K區關鍵區域546 bp,因此不能排除ATM其他區域發生突變而影響其放射敏感性的可能性;另一方面,細胞的放射敏感性的改變涉及多種分子生物學過程[21-22],所以ATM基因突變以外的因素也可影響其放射敏感性。

[1]Yao KC,Komata T,Kondo Y,et al.Molecular response of hum an glioblastoma multiforme cells to ionizing radiation：cell cyc le arrest,modulation of the expression of cy clin-dependent kinase inhibitors,and autophagy[J].J Neu rosurg,2003,98(2)：378-384.

[2]陶勝忠,牛光明,尹先印,等.不同放射敏感性膠質瘤中 ATM蛋白、NF-κB表達及相關性研究[J].中國實用神經疾病雜志,2008,11(8)：7-9.

[3]Pandita TK.ATM function and telomere stability[J].Oncogene,2002,21(4)：611-618.

[4]Khanna KK,Jackson SP.DNA double strand b reaks：signaling,repair and the cancer connection[J].Nat Genet,2001,27(3)：247-254.

[5]Canm an CE,Lim DS,Cimprich KA,et al.Activation of the ATM kinase by ionizing radiation and phosphorylation of p53[J].Science,1998,281(5383)：1 677-1 679.

[6]Pandita TK,Lieberm an HB,Lim DS,et al.Ionizing radiation activates the ATM kinase th roughout the cell cycle[J].Oncogene,2000,19：1 389-1 391.

[7]Bradshaw PS,Condie A,M atutes E,et al.Break points in the ataxia telangiectasiagene arise at the RGYW somatichy permutation motif[J].Oncogene,2002,21(3)：483-487.

[8]任軍,何偉,彭程,等.ATM基因與細胞放射敏感性[J].中華放射腫瘤學雜志,2003,12(2)：139-141.

ATM protein levelbefore and after radiation and genemutation of ATM/P-I3K region in glioblastomam ulti-form e cell

Tao Shengzhong,Yin X ianyin,N iu Guangm ing,eta l.Departmentof Neurosurgery,the Second A f f iliated Hosp italof Zhengzhou University,Zhengzhou450014,China

ObjectiveG lioblastomamu ltiforme(GBM)is one of themalignanciesmost resistant to radiation therapy.The aims ofour study w ere as follow s：firstly,quantify ATM protein level in GBM before and after radiation;second ly,detection of ATM genemutation to define the correlation betw een g liob lastoma multiforme cell radiosensitivity and gene mutation in the ATM/PI3-K coding region.M ethods ATM p rotein level in U 251 cell line and 5 cases primary cu ltureof GBM beforeand after radiation w ere determ ined by Flow cytometry;RT-PCR was used to get a 546bp fragmentof ATM cDNA form U251 cell line and p rimary culture of GBM,containing the phosphatidy linositol-3-kinase(PI3-K).Direct sequencing of RT-PCR p roductw as app lied to determ ine themutations in the gene.Resu lts In the U251 cell line and 5 cases primary cu lture of GBM,the authors demonstrated a transient increase in theexpression of A TM protein level after radiation,ATM protein can be up-regulated in response to radiation,but w ith no statistic difference(P＞0.05);U 251 cell line exp ressed ATM p rotein and ATM m RNA at considerably lower levels than primary tumors(P＜0.05).The sequenceof the 546bp fragment was identical to thoseof ATM gene published in gene bank.No genemutation was detected in the ATM/PI3-K region of GBM.ConclusionThe activity of ATM p rotein kinase is not associated with the expression levels of ATM p rotein.It indicates that there are no correlations betw een themutation of ATM/PI3-K and the radiosensitivity in GBM.The radiosensitivity of GBM may depend on some other factors and w ithout being related to ATM/PI3-K mutations.

GBM;A taxia telangiectasiamutated protein;ATM/PI3-K

R730.264

A

1673-5110(2011)09-0001-03

河南省青年骨干教師項目資助

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(收稿2011-04-03)