鹽度變化對鹽藻生物量和總脂含量的影響

韋芳三 ，李純厚 ，戴 明 ，呂國敏 ，肖雅元 ，胡維安 ，李 琦

（1.中國水產科學研究院南海水產研究所，農業部海水養殖生態與質量控制重點開放實驗室，廣東 廣州 510300；2.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306）

鹽生杜氏藻（Dunaliella salina Teodoresce）又名鹽藻（Dunaliella salina），隸屬于綠藻門（Chlorophyta）團藻目（Volvocales）多毛藻科（Polyblepharidaceae）杜氏藻屬（Dunaliella,Teodoresco），為低等真核生物[1]。國內外對海洋綠藻的脂肪含量研究主要集中在小球藻屬Chlorella[2-4]、微綠球藻屬Nannochloris[5-7]、四片藻屬 Tetraselmis[8-9]和杜氏鹽藻屬Dunaliella[4-10]。進一步對11個屬海洋綠藻的30個藻株的總脂肪含量和脂肪酸組成進行測定發現，海洋微藻的脂肪含量遠高于海洋大型藻類，而且海洋綠藻總脂含量大部分都比較高，為干重的4.52%～34.49%[11]，其中杜氏鹽藻僅次于小球藻，居于第二位，其總脂含量為7.14%～29.91%。一些研究也表明，海洋微藻的總脂含量存在著明顯差異，其中鹽藻的總脂含量最高，最高可達到干重的28.71%[12]，李荷芳等[4]測定的一株杜氏鹽藻（Dunaliella sp.）的總脂含量為30.00%。國內外的科學家利用各種方法篩選出了幾種含油脂量較高的藻種，包括小球藻、鹽藻和角毛藻（Cheatoceros sp.）等，為低成本的生物燃料的生產提供了原料支持[13]。由此可見，在微藻生物質能源的研究中，鹽藻是最佳選擇材料之一。

海水鹽度對海洋生物的影響主要表現在滲透壓和比重上的作用。鹽度對微藻的影響是多方面的，它不僅影響微藻的生長，而且影響微藻細胞內脂肪的積累，有關鹽度對微藻脂類組成的影響只在少數藻類中作過研究報道。為了獲得高生物量和高油脂含量的海洋產能微藻，采用單因素試驗研究了鹽度對鹽藻生物量和脂肪積累的影響，以期為海洋微藻生物質能源的研究與開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

藻種由中國水產科學研究院南海水產研究所提供，選用經培養到指數生長期的單一鹽藻（Dunaliella salina）作為試驗藻種。

1.2 方法步驟

1.2.1 培養用水和營養鹽 海水取自深圳楊梅坑，經過黑暗沉淀7 d以上，300目篩娟、活性炭和過濾棉過濾，煮沸、冷卻，其pH約8.4，鹽度約32.9。營養鹽組成：FeC6H5O73.9 mg/L，NaNO317.8 mg/L，NaH2PO44.4 mg/L，CO（NH2）210 mg/L，ZnSO424 μg/L，MnCl2176 μg/L，CuSO410 μg/L，CoCl2·2H2O 12 μg/L，Na2EDTA 4.3 mg/L。

1.2.2 試驗設計 自然海水中加純凈水或氯化鈉，設計 5個鹽度梯度，即Ⅰ：20、Ⅱ：40、Ⅲ：60、Ⅳ：80和Ⅴ：100（取整數，下同），每試驗組設3個重復，自然海水鹽度32.9。150 mL藻液，置于磁力攪拌器上培養，攪拌速度約為200 r/min。培養期間，以熒光燈為光源，光照強度2 500～3 000 lx（上海市嘉定學聯JD-3照度計），光照與黑暗比9 h∶15 h，溫度25±3℃，接種密度約為64×104mL藻細胞，初始pH為8.0。每日顯微觀察和測吸光值，間隔3～5 d補充營養鹽，培養到指數生長末期后收獲并測定細胞內脂肪含量。

1.2.3 生長測定 藻細胞生長情況采用XB.K.25.血球記數板計數和紫外分光光度計（752-P）測光密度，記OD520，計數前先用4%甲醛固定，每瓶測定兩次，取平均值。相對生長率的計算公式（1）[14]如下：

其中，N0是開始時的細胞數，Nt為經過T時間后的細胞數。

1.2.4 藻生物量的采收與測定 將藻液放在已經干燥稱量的離心管A（W1）中，5 000 r/min離心15 min（LXJ-JIB低速大容量多管離心機），去上清液，獲得藻泥。將管A置于烘箱（DGX-9003）內45℃烘干至恒重，獲得藻干物質，取出管A冷卻至室溫后稱重（W2）。（W2-W1）/藻液體積即為微藻的生物量，單位g/L。

研究鹽藻生物量與OD520的線性關系，設計10個樣品，取生長至指數生長末期的藻液，其體積從10～1 mL，然后分別加海水 0～9 mL，每個樣品設 3個平行組，分別測吸光值和生物量。

1.2.5 微藻粗脂肪百分含量的測定 利用脂肪能溶于脂溶性溶劑這一特性，用脂溶性溶劑無水乙醚提取藻細胞內的脂肪，蒸發除去溶劑后測定脂肪含量的方法。參照陳昱[15]脂肪提取的方法并做某些改進：取3 mL培養液于稱量已經干燥的離心管A（W1），5 000 r/min 離心 5 min（LXJ-JIB 低速大容量多管離心機），去除上清液。將管A置于烘箱（DGX-9003）內45℃干燥至恒重，取出管A冷卻至室溫搗碎成藻粉后稱重（W2）。往離心管中注入約2 mL的無水乙醚，浸泡過夜后振蕩，抽提2 h，5 000 r/min離心5 min（LXJ-JIB低速大容量多管離心機），將上清液轉移至已稱量（W3）的干凈離心管B中。風干管B內的乙醚，將其置烘箱（DGX-9003）內45℃干燥至恒重，取出管B冷卻至室溫后稱重（W4）。粗脂類（%）=（W4-W3）/（W2-W1）×100，即為微藻粗脂肪含量。

2 結果與分析

2.1 鹽藻生物量與吸光值的線性關系

生物量是影響微藻能源產業化成本的關鍵因素之一，為了能夠快速而準確地測定生物量的大小，將藻液稀釋一定的倍數，共10個樣品，各設3個重復組，分別測定其吸光值和生物量，取其平均數（和）作圖（圖1），得出鹽藻生物量與其吸光值的線性關系。

圖1 鹽藻生物量與吸光值的線性關系

圖1所示鹽藻生物量與吸光值線性相關，相關系數R2大于0.9，說明在此吸光值范圍內，鹽藻生物量和吸光值的相關性良好，鹽藻生物量和吸光值的線性關系如公式（2）。

其中，Y表示鹽藻生物量，單位g/L，X表示在520 nm波長下的吸光值OD520。

2.2 鹽度對鹽藻生物量的影響

根據上述試驗方法培養鹽藻，分別測定指數生長末期的生物量，應用SPSS數據處理軟件作圖，結果見圖2。如圖2所示，在收獲時期（指數生長末期）不同鹽度對鹽藻生物量的影響，從圖可以看出，Ⅱ號試驗組，即鹽度40最大生物量大于1 g/L，接近鹽度80的2倍。在鹽度20～40的范圍內，鹽藻生物量隨著鹽度的增加而增大，而鹽度在40～80的范圍，又表現出高鹽度不利于鹽藻生物量的積累。

圖2 不同鹽度梯度下收獲鹽藻的生物量

測定不同鹽度水平時鹽藻的生物量，然后用Dps數據處理系統進行方差分析和多重比較。結果表明，鹽度變化對鹽藻生物量的影響具有顯著作用。在鹽度40時可以收獲最高的生物量，在鹽度80時生物量最小，僅為0.60 g/L。經Duncan`s新復極差測驗多重比較，5個鹽度水平之間都是差異極顯著。綜合不同鹽度下鹽藻的生物量和多重比較的結果可以認為，鹽度在30～60的范圍鹽藻的生物量高，鹽度過高或過低均抑制鹽藻的生物量。

2.3 鹽度對鹽藻總脂肪含量的影響

圖3表明，鹽藻在鹽度40時總脂肪含量最高，含脂占干重的33.84%。如果鹽度高于或低于40，它們的總脂肪含量隨鹽度的升高或降低而減少。分析結果表明，鹽度40與鹽度20、60、80和100的差異極顯著（p<0.01），鹽度60與鹽度80差異顯著（0.01

圖3 不同鹽度梯度下鹽藻的脂肪含量

3 討 論

鹽藻是廣鹽性的單細胞浮游植物，它對滲透脅迫的適宜能力強，可以在接近淡水，直至飽和鹽水的環境中生存。相對于其它藻類，鹽藻是耐鹽性最強的單細胞藻，它能生長于海水及咸水湖、鹽湖等高鹽環境下。有試驗結果顯示，牟氏角毛藻細胞生長的適宜鹽度范圍是18.5～23.5，最適宜的鹽度為21.0。低鹽度下藻細胞生長緩慢，達到穩定期的時間長；高鹽度下藻細胞生長較快，生長周期較短[16]。鹽度對綠色巴夫藻生長無影響。鹽度25最適合于等鞭金藻3011的生長[17]。本試驗結果顯示在鹽度20～100范圍內，鹽藻均能正常生長，可以收獲比較高的生物量。有研究[18]顯示，在超過200的高鹽度下鹽藻依舊能生長良好。由圖2可知，在鹽度40時，生物量達到最高值，為1.19 g/L，在鹽度80時生物量最低，為0.60 g/L。這表明鹽度是影響鹽藻生長和生物量的最主要因素之一。

鹽度對微藻總脂肪含量的影響機理尚未清楚，可能是通過鹽度的調節快速增加或降低細胞內甘油的含量，與外液形成滲透平衡。細胞內可用性物質如甘油、硝酸鹽、結構蛋白和自由氨基酸的積累都是對鹽度適應的結果[19]。大量研究表明，改變培養條件，如培養基成分、光強、溫度、通氣量和生長期以及在不同的時期收獲對微藻的脂肪含量和脂肪酸組成有著顯著影響[20]。除此之外，環境因子在決定微藻脂類的種類和數量方面起著重要作用[21]。有研究顯示兩種金藻分別在鹽度20和鹽度30時總脂肪含量最高，含脂量分別占干重的26.3%和30.3%。從圖3可以看出，鹽藻的總脂肪含量在鹽度40時最大，100時最小，并且當鹽度大于40時，總脂肪含量隨鹽度的增加呈現微略變小的趨勢。因此，在鹽藻生物質能源的研究過程中，為獲得高的生物量和脂肪含量，應該選擇的鹽度的范圍是30～40。

鹽藻作為生物質能源的材料，與其生物量和脂肪含量密不可分，因為制約微藻能源產業化的主要原因是生產成本，而影響生產成本的關鍵因素是微藻的生物質產量和油脂含量，即要求具備低成本生產大量富油微藻的能力[22]。在本試驗中發現鹽藻在鹽度40時能夠收獲最大的生物量（1.19 g/L）和積累更多的脂肪（33.84%），這稍高于李荷芳[4]測定的一株杜氏鹽藻（Dunaliella sp.）的總脂肪含量30.00%。此結果表明，鹽藻作為生物質能源有巨大的開發潛力，今后可以大規模養殖鹽藻，用于生物質能源開發利用。

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