溫度對(duì)擬環(huán)紋豹蛛乙酰膽堿酯酶體軀分布的影響

龔 忱，王 智

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中，蜘蛛是農(nóng)作物害蟲的重要捕食性天敵，是水稻害蟲自然控制的重要生物因子。其中擬環(huán)紋豹蛛（Pardosa pseudoannulata）是農(nóng)田蜘蛛中的重要優(yōu)勢(shì)種群，在我國(guó)南方稻區(qū)，屬常年優(yōu)勢(shì)種[5]。

擬環(huán)紋豹蛛屬蛛形綱、蛛形目、狼蛛科。雌蛛：體長(zhǎng)10～14 mm。頭胸部背面正中斑呈黃褐色，前寬后窄，正中斑前方具1對(duì)色澤較深的棒狀斑，中窩粗長(zhǎng)呈赤褐色。背甲兩側(cè)的側(cè)縱帶呈暗色。前眼列平直并短于第二眼列，第二行眼大。額高為前中眼的2倍。胸板黃色，在第1/2、2/3、3/4對(duì)步足基節(jié)間的部位各有1對(duì)黑褐色斑點(diǎn)。步足褐色，具淡色輪紋，各脛節(jié)有2根背刺。腹部心臟斑呈槍矛狀，其兩側(cè)有數(shù)對(duì)黃色橢圓形斑，前兩對(duì)呈“八”字形排列，其余數(shù)對(duì)左右相連，每個(gè)斑中各有1個(gè)小黑點(diǎn)。外雌器中部有1窄長(zhǎng)突起。雄蛛：體長(zhǎng)8～10 mm。體色較暗。胸板呈黑褐色。成蛛壽命的長(zhǎng)短與溫度、營(yíng)養(yǎng)條件有關(guān)。在20℃恒溫條件下，平均壽命在100 d左右；25～32℃溫區(qū)內(nèi)，平均壽命在80 d左右；在35℃恒溫條件下，只有40 d左右。越冬代成蛛可生活346 d。

擬環(huán)紋豹蛛在湘西北1年發(fā)生2～3代，第3代不完整，以第2代歷期最短,第3代(越冬代)歷期最長(zhǎng)；以成蛛、亞成蛛或幼蛛越冬，其分布圖式為聚集分布；4月下旬即由田埂向稻田內(nèi)遷移，在水稻生育期有3次數(shù)量高峰；屬游獵型蜘蛛，可步行在水稻、水面、陸地等處捕食飛虱、葉蟬等多種目標(biāo)害蟲；受驚時(shí)潛入水中或潛伏。雌雄蛛均可多次交配，雌蛛一生最多可產(chǎn)卵5次，實(shí)驗(yàn)種群卵囊含卵量76～337粒,平均156粒。孵化的幼蛛，先群集在雌蛛背面，3～5 d后開始擴(kuò)散，6～7 d擴(kuò)散到高峰。幼蛛期 47～158 d；成蛛期 121～236 d，雌蛛較雄蛛長(zhǎng) 21～62 d。除第2代外，各代性比均為雄性多于雌性。

擬環(huán)紋豹蛛個(gè)體大，空間生態(tài)位寬，是水稻基部、莖部和葉面害蟲的重要捕食性天敵，對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力強(qiáng)，田間種群數(shù)量大，對(duì)稻飛虱、稻葉蟬等主要目標(biāo)害蟲的捕食量大，控制作用強(qiáng)，因此在害蟲防治中起著重要的作用。從擬環(huán)紋豹蛛的生物學(xué)、行為學(xué)和生態(tài)學(xué)特性看，該蛛生長(zhǎng)歷期長(zhǎng)，每代產(chǎn)卵次數(shù)多，產(chǎn)卵量高，孵化率和成活率高。因此，該蛛不僅有重要的保護(hù)和利用價(jià)值,而且很適合于人工飼養(yǎng)與繁殖[6]。

乙酰膽堿酯酶，簡(jiǎn)稱AChE（也稱真性膽堿酯酶），活性高，參與神經(jīng)肽的代謝，具有調(diào)節(jié)神經(jīng)元電活動(dòng)、神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育以及神經(jīng)再生的功能。乙酰膽堿酯酶的活性直接關(guān)系到蜘蛛對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥神經(jīng)中毒的抗性。有機(jī)磷進(jìn)入機(jī)體后迅速與膽堿脂酶結(jié)合形成磷酰化膽堿脂酶，抑制膽堿脂酶活性，造成大量乙酰膽堿在體內(nèi)的蓄積而發(fā)生癥狀，形成有機(jī)磷中毒所致的精神障礙。乙酰膽堿酯酶是乙酰膽堿（ACh）的水解酶，將ACh分解為膽堿和乙酸后失活，可以用來緩解有機(jī)磷中毒癥狀[1]。AChE的敏感度降低是節(jié)肢動(dòng)物對(duì)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑產(chǎn)生抗性的重要機(jī)理之一，因此了解影響AChE活性的因素十分重要。

乙酰膽堿酯酶存在于神經(jīng)元和肌細(xì)胞之間的突觸上。它“耐心等待”并在信號(hào)通過之后迅速發(fā)揮作用。將乙酰膽堿降解為二部分，乙酸和膽堿。此過程有效地終止了信號(hào)，使得降解產(chǎn)物得以回收，為下次傳導(dǎo)重建新的神經(jīng)遞質(zhì)。乙酰膽堿酯酶是生物體中反應(yīng)最快的酶之一，降解一個(gè)分子約80微秒[10]。

越來越多的研究提示，AChE可能與細(xì)胞的發(fā)育和成熟有關(guān)，證據(jù)如下。（1）許多胚胎組織富含AChE；（2）各種原發(fā)性腫瘤組織及其些癌癥病人的血清中AChE的活性增加；（3）AChE與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生過程關(guān)系密切。

生化分析和組織化學(xué)研究提示，在發(fā)育過程中，AchE與神經(jīng)細(xì)胞的增殖和神經(jīng)元突起的長(zhǎng)出有關(guān)，由于在發(fā)育過程中AChE出現(xiàn)在不同類型細(xì)胞發(fā)育的相同時(shí)期，而AchE的出現(xiàn)時(shí)期正好和細(xì)胞的增殖，遷移，突起的長(zhǎng)出時(shí)間及突觸建立的早期階段一致。總之，盡管目前缺乏直接的證據(jù)，但越來越多的研究結(jié)果支持這樣的推測(cè)：在神經(jīng)發(fā)育過程中，AChE可能作為一種特異的神經(jīng)分泌蛋白，在細(xì)胞內(nèi)或分泌到細(xì)胞外調(diào)節(jié)神經(jīng)元的增殖和突起的長(zhǎng)出[18]。

1 材料和方法

1.1 材料

擬環(huán)紋豹蛛從湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)田中捕捉，并將其分裝在試管中（用棉花封口）。

1.2 主要試劑

pH 8.0、0.067 mol/L 磷酸緩沖液，1×10-3mol/L毒扁豆堿溶液（化學(xué)純），0.01 mol/L DTNB溶液（分析純），8×10-2mol/L 乙酰膽堿（分析純），1×10-4mol/L還原谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)溶液（分析純）。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器

10 mL 試管，2 mL 移液管，研磨器，1 000 μL 移液槍，恒溫水浴箱，高速冷凍離心機(jī)，分光光度計(jì)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法和步驟

1.4.1 實(shí)驗(yàn)材料的預(yù)處理 將擬環(huán)紋豹蛛分組，每5只一組，分成2組，分別置于4℃冰箱中和常溫下饑餓處理3 d。

1.4.2 乙酰膽堿酯酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)備6只10 mL 的試管，分別標(biāo)號(hào)為對(duì)照、1、2、3、4、5。按表 1依次加入各試劑。

表1 乙酰膽堿酯酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法 （mL）

為了便于計(jì)算產(chǎn)物的生成量，使用與產(chǎn)物等摩爾比的還原谷胱甘肽繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為還原谷胱甘肽的微摩爾數(shù)，縱坐標(biāo)為相應(yīng)的光吸收值（圖 1）。

1.4.3 擬環(huán)紋豹蛛勻漿的制備 將預(yù)處理好的2組擬環(huán)紋豹蛛分為頭胸部、腹部、附肢3部分，分別放入離心管中并編號(hào)，加入1 mL磷酸緩沖液，再依次用研磨器冰浴研磨成勻漿，5 000 r/min冷凍離心15 min，取上清液備用。

1.4.4 酶活性測(cè)定操作方法 準(zhǔn)備7只10 mL試管，按表2編號(hào)并依次加入各試劑[21]。

圖1 乙酰膽堿酯酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

表2 乙酰膽堿酯酶的酶活性測(cè)定操作方法 （mL）

2 結(jié)果與分析

按上述步驟進(jìn)行試驗(yàn)，得出結(jié)果如表3、表4。

表3 擬環(huán)紋豹蛛在4℃條件下乙酰膽堿酯酶比活力體軀分布

表4 擬環(huán)紋豹蛛在常溫條件下乙酰膽堿酯酶比活力體軀分布

擬環(huán)紋豹蛛在4℃和常溫條件下頭胸部的AChE活性分別占各自總活性的43.7%和43.9%；腹部的AChE活性分別占各自總活性的39.6%和41.9%；附肢的AChE活性分別占各自總活性的16.7%和14.2%。

從表3和表4可知，無(wú)論是4℃條件下還是常溫條件下，AChE活性都是以頭胸部最高，腹部次之，附肢最低。這主要是因?yàn)轭^胸部是蜘蛛的神經(jīng)中樞集中地，AChE參與調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿（ACh）傳導(dǎo)的結(jié)果。

從上述結(jié)果還可發(fā)現(xiàn)，4℃條件下擬環(huán)紋豹蛛的AChE總活性及各部分的AChE活性均低于常溫條件下擬環(huán)紋豹蛛的AChE活性。這說明低溫能抑制擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)的AChE活性。但經(jīng)低溫處理后擬環(huán)紋豹蛛各部分的AChE活性分布總規(guī)律基本沒有發(fā)生改變。

3 小結(jié)與討論

無(wú)論是4℃低溫處理還是常溫條件，擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)各部分均含有較高活性的AChE，但常溫條件下擬環(huán)紋豹蛛AChE總活性及其各部分的AChE活性均高于4℃低溫處理的蜘蛛AChE活性。在低溫條件下，擬環(huán)紋豹蛛的各種生理活動(dòng)均會(huì)不同程度的下降，神經(jīng)傳導(dǎo)亦然，說明低溫對(duì)AChE活性有一定的抑制作用。

擬環(huán)紋豹蛛的AChE主要集中在頭胸部。AChE的這種分布特征是與其生理特性相適應(yīng)的，AChE主要分布于動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)和脊椎動(dòng)物的紅血球及肌肉中。

通過不同溫度處理擬環(huán)紋豹蛛，結(jié)果表明AChE的體軀分布總規(guī)律未發(fā)生改變，這種分布規(guī)律可能是由其種群的遺傳機(jī)制決定的。

乙酰膽堿酯酶參與節(jié)肢動(dòng)物神經(jīng)沖動(dòng)的傳遞，同時(shí)也是有機(jī)磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的作用靶標(biāo)。AChE的敏感度降低是節(jié)肢動(dòng)物對(duì)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑產(chǎn)生抗性的重要機(jī)理之一，因此了解影響AChE活性的因素十分重要[5]。本文以溫度對(duì)擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)AChE體軀分布的影響及其活性特征做了初步的研究，希望能為相關(guān)研究提供一些有意義的信息。

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