紫云英根瘤菌培養基的選擇與優化

陳海榮，郭照輝，劉前剛，劉清術

（湖南省微生物研究所，湖南 長沙 410009）

紫云英又名紅花草，豆科黃芪屬植物，主要分布在長江中下游和華南地區，在海拔400～3 000 m的地帶生長良好，是一種重要的綠肥、飼料兼用作物。人們發現，根瘤菌與豆科植物共生固氮體系是自然界固氮效率最高、固氮量最大的生物固氮體系[1-2]。我國陳華癸和徐明光最先獲得紫云英根瘤菌有效菌株[3]。隨后，人們對紫云英根瘤菌進行了多方面的研究，發現采用紫云英根瘤菌劑接種能使作物增產20%～30%，效果顯著。在初次栽種紫云英的土壤中接種有效根瘤菌是種植成敗的重要因素，多年種植紫云英的地區接種優良菌株也能促進地上部分增產[4]。因此，開發一類高效的紫云英固氮菌劑對提高紫云英的產量，增加稻田土壤肥力具有重要意義。根瘤菌接種效果與根瘤菌株的的固氮能力、競爭結瘤能力和活菌數有關。筆者以中慢生華癸根瘤菌13004#菌株為供試菌株，篩選優質高效的培養基，提高根瘤菌的活菌數，以期為根瘤菌劑的生產提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌 株 中慢生華癸根瘤菌（Mesorhizobium huakuii）13004#菌株，為紫云英中慢生根瘤菌，從中國農科院菌種保藏中心引進。

1.1.2 培養基 YMA培養基：甘露醇 10 g/L，酵母粉 1 g/L，K2HPO40.5g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，NaCl 0.1 g/L，CaSO40.2g/L，Rh微量元素液 4 mL/L（Rh微量元素液：H3BO35 g/L，Na2MnO45 g/L），pH 6.8～7.0。

SM培養基：甘露醇 10 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，NaCl 0.1 g/L，CaCl20.05 g/L，KNO30.5 g/L，Rh微量元素液 4 mL/L（配方同上），混合維生素液1 mL（混合維生素液：硫胺素10 mg/L，煙酰胺 10 mg/L，泛酸鈣 10 mg/L，生物素 1 mg/L），pH 6.8～7.0。

63#培養基（中國農科院網站提供）：蔗糖 10 g/L，酵母粉 1 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，NaCl 0.1 g/L，CaSO40.2 g/L，1%H3BO31 mL/L，1%Na2MnO41 mL/L，1%檸檬酸鐵 1 mL/L，1%MnSO41 mL/L，pH 6.8～7.0。

TY培養基：胰蛋白胨5 g/L，酵母粉3 g/L，CaCl21.3 g/L，pH 6.8～7.0。

BSE培養基：甘露醇 10 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，NaCl 0.1 g/L，CaCl20.05 g/L，Rh微量元素液4 mL/L（配方同上），豆芽汁1 000 mL，pH 6.8～7.0（豆芽汁配方：500 g鮮豆芽加入1 500 mL水煮沸30 min后，用紗布過濾即得）。

種子培養基：用YMA培養基作為種子培養基。活菌數計數培養基：YMA固體培養基（YMA液體培養基+2%瓊脂粉）。

1.2 試驗方法

1.2.1 根瘤菌菌株的分離活化、傳代、接種和培養在YMA固體培養基平板上分離根瘤菌株，將單菌落接入斜面傳代培養作為菌種。然后將斜面的菌種接入種子培養基中，30℃，160 r/min培養18 h。最后按2%的接種量將種子培養基中菌液接種到液體培養基，恒溫振蕩培養箱內，160 r/min，30℃培養。

1.2.2 根瘤菌在5種培養基中生長情況的測定培養24 h后開始計數，每6 h計數一次。計數采用平板計數法，稀釋倍數取107、108、1093個梯度，每個梯度3個平行，取菌落數在30～150個的平板讀數，計算3個平板的平均值。

1.2.3 培養基碳源的篩選 以5個培養基中活菌數最高的培養基為母本，進行碳源篩選試驗。分別用等量的蔗糖、葡萄糖、甘露醇、麥芽糖及甘油進行試驗，培養基其他成分不變。按2%接種量從種子培養基中接入上述培養基，取24、36、48 h 3個時間點進行活菌數測定，選出最佳碳源。

1.2.4 培養基氮源的篩選 確定最佳碳源后，將培養基中的氮源用等量的酵母粉、蛋白胨、大豆粉、魚粉進行試驗，培養基其他成分不變。按2%接種量從種子培養基中接入上述培養基，取24、36、48 h 3個時間點進行活菌數測定，選出最佳氮源。

1.2.5 正交設計優化選定培養基主要成分 對培養基中的碳源、氮源、磷源及MgSO44種主要成分進行L9（34）正交設計試驗。培養48 h后，用分光光度計測定其600 nm下的OD值，分析4種物質對根瘤菌的影響度及最佳劑量組合。

1.2.6 驗證試驗 用1.2.5中得到的最佳培養基與試驗中的活菌數最高的培養基進行活菌數比較，驗證正交試驗結果是否準確。

2 結果與分析

2.1 紫云英根瘤菌在5種不同培養基中生長狀況比較

根據 13004#根瘤菌在 YMA、SM、63#、TY 和BSE培養基中的生長情況所測的的活菌數繪制曲線，結果如圖1所示。由圖1可知，13004#菌株在5種培養基中均能生長，在YMA、63#和BSE培養基中生長速度較快，活菌數較高，但在SM和TY培養基中表現較差。比較3種表現較好的培養基，BSE中豆芽受季節條件限制，不利于生產；63#培養基成本較高，因此，YMA培養基是紫云英根瘤菌13004#菌株較為理想的培養基。

2.2 根瘤菌對不同碳源的利用情況

YMA培養基其它成分不變，碳源分別用等質量的甘露醇、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖及甘油做對比試驗，平板計數法測得24、36和48 h活菌數，結果如圖2所示。由圖2可知，13004#根瘤菌在甘露醇和蔗糖中生長較好，甘露醇略優于蔗糖，在麥芽糖中次之，在葡萄糖和甘油中成長較差。因甘露醇在生產成本上要遠高于蔗糖，故選定蔗糖為根瘤菌培養基碳源。

2.3 根瘤菌對不同氮源的利用情況

確定以蔗糖為碳源后，將YMA中的氮源用等質量的蛋白胨、酵母粉、大豆粉及魚粉代替，其它成分不變，做對比試驗。平板計數法測得24、36和48 h活菌數，結果如圖3所示。由圖3可知，根瘤菌在以酵母粉為氮源的培養基中生長效果最好，蛋白胨次之，大豆粉和魚粉的利用效果差。

2.4 正交優化結果

在確定蔗糖、酵母粉分別為碳源和氮源后，對培養基中4種主要成分：蔗糖、酵母粉、K2HPO3、Mg－SO4·7H2O做正交設計試驗，以確定最佳組合劑量。正交設計方案及結果如表1所示。由表1可知，13004#根瘤菌株在2號培養基中生長最好，其次為1號培養基，在9號培養基中生長最差。經極差分析，4種培養基成分對菌株生長結果的影響順序為：蔗糖＞酵母粉＞K2HPO4＞MgSO4·7H2O，培養基最佳劑量組合為A1B2C1D2，即蔗糖10 g，酵母粉3 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g。

表1 根瘤菌L9（34）培養基優化正交試驗設計及結果

2.5 驗證試驗

以正交設計得到的A1B2C1D2配方做培養基，與正交試驗中生長最好的2號培養基以及原始YMA培養基做對比試驗，培養基其它成分以YMA培養基為參考。菌株在培養24、36、48 h用平板計數法測定3種培養基中活菌數，結果如圖4所示。由圖4可以看出，經過正交試驗得到的培養基在24、36、48 h的活菌數均高于其他兩種培養基，可以初步判斷，正交試驗結果準確，得到的新培養基比原始培養基好。

3 總結與討論

關于根瘤菌培養基的優化問題，不少學者已作過研究[5-8]，但主要集中在大豆和花生等經濟作物上，對紫云英根瘤菌的研究相對較少。本試驗證明YMA培養基比較適合紫云英根瘤菌13004#菌株。

碳源和氮源利用試驗表明，甘露醇和蔗糖是該菌株比較理想的碳源，因甘露醇價格相對較高，選擇蔗糖作為碳源，性價比更高；而酵母粉是該菌株優秀的氮源選擇。正交試驗及活菌數驗證得出培養基最佳配方如下：蔗糖 10 g，酵母粉 3 g，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，NaCl 0.1 g/L，CaSO40.2 g/L，Rh微量元素液 4 mL/L，pH 6.8～7.0。

選擇高活菌數的培養基是生產優質紫云英根瘤菌肥的第一步，保持菌肥中長期高效的活菌數是生產根瘤菌肥的關鍵。在菌肥的劑型上，固態菌肥保質期長，活菌數較少，易污染程度高；液態菌肥活菌數高，保質期短，交通運輸不便，如何把兩者的優點有機地結合起來還需要進一步的研究。

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