水稻蛋白OsOle對葉片表皮細胞形態的影響分析

姚清國，段書德，張文娜

（石家莊學院化工學院，河北 石家莊 050035）

在多細胞生物中，細胞與細胞之間的相互通訊是不可缺少的，細胞之間的相互識別對于細胞生長和分化起著決定的作用，其中植物胞外的信號分子在細胞之間的信息傳遞中扮演者重要的角色[1]。在植物學研究中，小分子激素如生長素、細胞分裂素、赤霉素、乙烯、ABA和油菜素類脂等一直是公認的信號分子，人們對其比較關注而且研究比較清楚。直到10年前，一篇評述性文章“Plants，like animals，may make use of peptide signals”在 Science上發表之后，人們才開始關注植物胞外蛋白作為細胞間信號分子的研究[2]。現在研究得比較清楚的胞外蛋白有 4 個，分別是系統素[3]、PSK[4]、CLV3[5]和SCR[6]。Olee 1是一種主要過敏原，該蛋白最早在橄欖樹的花粉中發現并純化，因此命名為Olee I[7]。Olee 1由145個氨基酸組成的，與已知的番茄花粉LAT52蛋白和玉米中的Zm13蛋白十分相似。Olee I的結構域中含有6個保守的半胱氨酸，一個保守的花粉表達的序列E/Q/T/-G-X-V-Y-C-D-T/N/P-C-R。在植物中存在一個與Olee 1同源的蛋白家族，稱為Olee 1蛋白家族，有些Ole家族的蛋白還富含脯氨酸，蛋白分子量從8 kD到50 kD，具有可溶性和穩定性，會引起IgE調節的過敏反應[8]。水稻基因組中有45個Olee 1家族的蛋白[9]，但它們的表達模式各不相同，推測可能參與不同的生物學過程，發揮不同的功能。筆者在水稻中找到一個與Olee 1同源并在授粉后RNA水平表達量明顯上調的基因，并對其生物學功能進行了初步的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

供試水稻品種為日本晴[Oryza sativa（japonica cultivar-group）]；細菌菌株 DH5α、農桿菌 EHA105均為本實驗室保存；載體 pTCK303、pCAMBIA 1300、pYFP、pGEX-2T 為本室保存。

1.2 方法

1.2.1 載體構建 載體構建所用的引物由生工公司或賽百盛公司合成，通過RT-PCR擴增出Os－Ole1連到pCAMBIA 1300上，構建成后面融合GUS的超表達載體并進行了測序；通過RT-PCR擴增出OsOle1連到pYFP上。forward primer（Pogf）：5′-CC A AG CTT ATG GCC TCT CTC CGC ACC-3′，reverse primer（Pogr）：5′-CGG GAT CCC CTC GTT ATC ATC ATC AGC CAG GAT-3′，構建成后面融合YFP的超表達載體。

1.2.2 水稻遺傳轉化和GUS染色 水稻遺傳轉化采用農桿菌介導水稻愈傷轉化的方法，收集轉基因水稻不同發育時期的組織，按照Jefferson的方法進行 GUS染色[10]。

1.2.3 激光共聚焦顯微鏡（LSCM）觀察 將上述打過基因槍的洋蔥表皮（仍在上述MS固體培養基的濾紙之上）放于22℃，連續光照條件下培養16 h，然后將洋蔥表皮置于MS緩沖液（pH 7.0）中。在Bio-Rad MR（A2）型激光掃描共聚焦顯微鏡上進行觀察。觀察條件：以488 nm為激發光，強度為30%。同時打開軟件對鏡中的目標細胞掃圖。再用質壁分離液（MS，0.15 mol/L的蔗糖，0.45 mol/L甘露醇）處理洋蔥表皮細胞，直至發生質壁分離，同時進行觀察拍照。

1.2.4 掃描電鏡觀察水稻葉片表皮細胞 掃描電鏡采用日立S-570型，分辨率3.5 nm，放大倍數20～200 000倍，取水稻的葉片，用二蒸水沖洗干凈，放入戊二醛（2.5%）中固定，采用梯度的方法進行脫水，依次放入30%、50%、70%、80%、90%、100%乙醇中，每次30 min。之后放入新的100%的乙醇過夜，第二天放入醋酸異戊脂30 min，放入預冷的干燥儀樣品室，注入液態的CO2進行置換，保持室溫20℃，壓力 50～70 Kg/cm2，20 min，溫度升到 40℃，壓力 80～100 Kg/cm2，保持 5min，放氣（速度在 100～500 mL）/min，當壓力低于30 Kg/cm2時切斷加熱器，取出樣品，真空噴金，然后放入掃描電鏡中觀察拍照。

2 結果與分析

2.1 OsOle1的生物信息學分析

橄欖樹花粉中發現的過敏原蛋白Olee 1在植物中屬于一個大的家族，在NCBI的水稻蛋白質數據庫中以橄欖樹Olee 1的氨基酸序列進行搜索，得到一個同源的蛋白（CAE05158.2），序列同一性為35%（45/128），相似性為 52%（67/128），蛋白對應的cDNA序列號為AL731591，該基因有一個內含子，因此命名為OsOle1，OsOle1共有165個氨基酸殘基，N端1-24位氨基酸為預測的信號肽序列，肽鏈斷裂位點在24位的Ala和25位Thr之間。

將OsOle1蛋白序列在NCBI的蛋白數據庫中進行比對，得到75個相似度比較高（e＜0.01）的蛋白序列。運用MEGA3.0對這些蛋白序列進行進化樹分析（圖1），發現OsOle1和水稻，百合和玉米中的同源蛋白蛋白分布在一個大的BII分支中分支中，該分支只有12個成員，全部為單子葉植物。擬南芥，番茄和橄欖樹中與OsOle1同源的蛋白分布在另外的幾個分支中，A，BI及CI、CII分支全部都是雙子葉植物，共有64個蛋白。由此可見，Ole家族的蛋白在單子葉和雙子葉植物進化中有明顯的區別。

圖1 Ole家族的進化樹構建

該進化樹中有功能注釋的5個蛋白分別是：橄欖樹中的Olee 1（P19963），擬南芥中的SAH7（NP567338），玉米中的Zm13（P33050），百合中LLP-B3（ANN76546），番茄中的 LAT52（P13347）。選取這五個蛋白與水稻中的OsOle1進行氨基酸序列比對分析，結果發現這些蛋白與花粉特異的Ole_e_I家族保守序列 [EQT]-G-x-V-Y-C-D-[TNP]-C R在相同的位置上都具有6個保守的半胱氨酸（圖2）。進一步分析OsOle1的氨基酸序列發現該蛋白有推測的豆蔻?；稽cG-{EDRKHPFYW}-X（2）-[STAGCN]-{P}，位于 N 端第 128 位，因此該蛋白容易被豆蔻?；揎楀^定于質膜上。OsOle1在N端第33位具有花粉中特異表達的保守序列[EQT]-G-x-V-Y-C-D-[TNP]-C R。

圖2 部分Ole e 1家族蛋白的保守序列比對分析

2.2 轉基因水稻的表型觀察

2.2.1 掃描電鏡觀察OsOle1超表達株系葉片在營養生長階段，對OVY3的T0代的小苗葉片進行觀察，和野生型葉片比較起來，OVY3株系葉片暗綠，推測葉片的表皮細胞可能發生改變，進一步對三葉期的OVY3的葉片作了掃描電鏡的觀察，結果如圖3所示。對野生型和OVY3葉片的近軸面觀察發現，野生型的葉片表皮細胞的細胞細長，細胞的邊界比較平滑，形狀規則。與野生型的相比，OVY3葉片近軸面表皮長細胞長度變短（圖3中箭頭所示），且形狀發生改變，表皮細胞周圍邊界變的不規則。表皮的短細胞變化不大。推測可能是由于OsOle1的超表達影響葉片進軸面的長細胞發育。

對野生型和OVY3葉片遠軸面觀察發現，野生型遠軸面表皮細胞的角質層突起比較平滑，細胞形狀比較細長。與野生型相比，OVY3葉片表皮細胞的形狀變的不規則，角質層突起比較粗燥（箭頭表示），每個角質層突起邊緣有許多小的突起（圖4下排），這種角質突起主要有蠟質來組成?？赡苁荗s－Ole1的超表達影響了葉片遠軸面臘質層的形成。

3 討 論

3.1 OsOle1與Olee 1在進化上的關系

在水稻基因組中有45個編碼Olee 1家族蛋白的基因，其中只有一小部分在花粉中特異的表達，而大部分在其它營養組織也有表達，推測水稻中這些基因可能發揮與Olee 1不同的生物學功能。

OsOle1主要在花器官中表達，在進化上與玉米的Zm13和百合的LLP-B3蛋白等單子葉植物聚在BII分支中，而與雙子葉的Olee 1家族的蛋白相距較遠。在雙子葉家族A亞家族中有一個番茄花粉中表達的LAT52蛋白，反義表達的LAT52影響花粉的水合和萌發。由于物種的不同，OsOle1、LAT52和Olee I在不同的進化分支中，三者之間有一定的距離，表明在雙子葉和單子葉在進化上出現分支后，該家族的蛋白為適應不同類型花粉的信號轉導方式而進化成不同的形式，在不同物種中可能發揮著不同的功能。結構分析發現，這些蛋白大都有保守的6個半胱氨酸的，兩半胱氨酸之間可以形成二硫鍵，二硫鍵的形成有助于蛋白維持一定的空間構象，對其功能的發揮起重要作用。

3.2 OsOle1與葉表皮細胞發育的關系

在OsOle1的過表達植株中觀察到野生型的顏色為淺綠色，而超表達的葉片暗綠色，近軸面和遠軸面表皮細胞形狀也變得不規則，而且遠軸面表皮細胞的乳狀突起的蠟質突起變得不規則，可能是OsOle1影響了表皮細胞的分化。蠟質層是在細胞內合成再分泌的胞外裝配而成的，OsOle1很可能影響了蠟質層在胞外的裝配過程。除此之外OsOle1的超表達還影響到花粉的萌發和植株的高度，后續的研究正在進行中。

[1]Julie E G，Stuart C，Lee H.Intercellular Peptide Signals Regulate Plant Meristematic Cell Fate Decisions[J].Science Signaling，2008，49（1）：53-55.

[2]Marx J.Plants，like animals，may make use of peptide signals[J].Science ，1996，237（6）：1338-1339.

[3]Beatrice B，Ian T B.Silencing the Hydroxyproline-Rich Glycopeptide Systemin Precursor in Two Accessions of Nicotiana attenuata Alters Flower Morphology and Rates of Self-Pollination[J].Plant Physiology，2009，149（4）：1690-1700.

[4]Yang H P，Matsubayashi Y，Nakamura K.Oryza sativa PSK gene encodes a precursor of phytosulfokine-α，a sulfated peptide growth factor found in plants[J].Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1999，96：13560-13565.

[5]Mari O，Hidefumi S，Youji S，et al.Arabidopsis CLV3 Peptide Directly Binds CLV1 Ectodomain[J].Science ，2008，319：294-295.

[6]Takayama S，Shimosato H，Shiba H，et al，Direct ligand-receptor complex interaction controls Brassica self-incompatibility[J].Nature ，2001，413：534-538.

[7]Kristina E，Bjorn W，Alf C.Molecular Population Genetics of the SRK and SCR Self-Incompatibility Genes in the Wild Plant Species Brassica cretica（Brassicaceae）[J].Genetics，2009，181：985-995.

[8]Villalba M.，Batanero E.，Lopez O C，et al.The amino acid sequence of Ole e I，the major allergen from olive tree （Olea europaea）pollen[J].Eur.J.Biochem.，1993 ，216；863-869.

[9]Shu Y J，Phua X ，Hua J，Yeo Y T ，et al.Genome-wide Identification and Molecular Characterization of Ole e I，Allerg 1 and Allerg 2 Domain-containing Pollen-Allergen-like Genesin Oryza sativa[J].DNA Research ，2 005，12：167-179.

[10]Jefferson R A，Kavanagh T A，Bevan M W.GUS fusions：betaglucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants[J].EMBO J，1987 ，6：3901-3907.