白藜蘆醇對胃癌細胞Ras相關結構域家族1A基因甲基化及表達的影響

黃明明 蔡衛東 劉永輝

白藜蘆醇對胃癌細胞Ras相關結構域家族1A基因甲基化及表達的影響

黃明明 蔡衛東 劉永輝

目的 探討白藜蘆醇對人胃癌SGC-7901細胞Ras相關結構域家族1A（RASSF1A）基因甲基化及蛋白表達的影響。方法 體外培養SGC-7901細胞，用不同濃度(0，10μM，20μM，40μg/ml)白藜蘆醇與其孵育48h。采用甲基化特異性PCR（MSP）檢測RASSF1A基因啟動子區域的甲基化改變情況；RT-PCR檢測RASSF1A的表達水平，并用Western blot檢測處理前后RASSF1A蛋白的表達。結果 白藜蘆醇能以劑量依賴性方式抑制SGC-7901細胞增值，隨著SNF濃度的增加，甲基化RASSF1A水平逐漸減弱，非甲基化RASSF1A水平逐漸增多。同時白藜蘆醇能明顯上調RASSF1A的mRNA和蛋白表達水平。結論 白藜蘆醇能使RASSF1A基因去甲基化，并上調非甲基化基因的表達水平，可能是其抗癌的重要因素。

白藜蘆醇;胃癌;Ras相關區域家族1基因

胃癌是消化系統最常見的惡性腫瘤。和其他惡性腫瘤一樣，胃癌的發生是由多因素、多步驟的復雜過程，涉及到機體細胞的基因及表型的改變[1]。近年來的研究發現，RAS相關結構域家族1A基因與胃癌的發生發展密切相關，可能是一種新型的抑癌基因[2-3]。在本研究中，我們探討了白藜蘆醇對人胃癌細胞SGC-7901 RASSF1A基因的甲基化以及表達情況的影響，從而為探討其臨床輔助治療提供依據。

1 材料和方法

1.1 細胞和主要試劑

胃癌SGC-7901細胞株購自中科院上海細胞庫。RPMI-1640培養基以及胎牛血清均分別為Invitrogen和杭州四季青公司產品。SFN(純度＞99%)購自Sigma公司，用二甲基亞砜(上海生工)溶解，4℃避光保存。細胞基因組提取試劑盒以及RNA酶購自大連寶生物。Trizol試劑、RT-PCR試劑購自Qiagen公司。β-actin多克隆抗體、HRP羊抗鼠IgG購自北京中杉公司，抗RASSF1A抗體購自eBioscience公司。

1.2 細胞培養與處理

SGC-7901細胞于37℃，5% CO2條件下，用含10%肽牛血清、1mM 谷氨酰胺、1%青霉素、1%鏈霉素的RPMI-1640培養基中培養。當細胞生長至對數期后，加入終濃度為0，10μM，20μM，40μg/ml白藜蘆醇處理48h。

1.3 甲基化特異性PCR（MSP）

按照試劑盒提供的方法獲取SGC-7901細胞全基因組DNA，用亞硫酸氫鈉修飾、純化基因組DNA。設計針對RASSF1A基因甲基化和非甲基化的特異性引物，并按照參考文獻提供的方法對其進行擴增[4]。擴條件為：94℃預變性7min；隨后進入35個循環：95℃變性30s→56℃復性30s→72℃延伸30s。最后一次循環結束后于72℃反應5min。

1.6 RT-PCR

Trizol法提取處理后細胞的RNA，用Qiagen公司提供的試劑盒對RASSF1A基因的mRNA水平進行擴增。PCR產物經瓊脂糖凝凝膠電泳后，將其與β-actin的灰度比值進行半定量分析。

1.7 Western blot

白藜蘆醇作用SGC-7901細胞后，加入等體積2×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸3min。超聲處理后取20μl蛋白進行SDSPAGE，轉印至硝酸纖維素膜（Millipore）后，用含5%脫脂奶粉的封閉液室溫封閉2h，用TBST液洗膜后，4℃下孵育一抗過夜。洗膜，加入HRP標記二抗室溫孵育1h。ECL發光、顯影，灰度掃描。

1.8 統計學處理

2 結果

2.1 白藜蘆醇處理對SGC-7901細胞RASSF1A甲基化的影響

SGC-7901細胞在0h可觀察到RASSF1A基因呈高甲基化。當其用10～40μM 白藜蘆醇處理48h后，RASSF1A基因的甲基化水平隨白藜蘆醇濃度的增加而降低。同時，而非甲基化條帶增加，如圖1所示。

圖1 白藜蘆醇對胃癌細胞RASSF1A基因甲基化影響M：甲基化基因；U：非甲基化基因

2.2 白藜蘆醇對SGC-7901細胞RASSF1A mRNA表達的影響

SGC-7901細胞經不同濃度白藜蘆醇處理48h后，RASSF1A基因mRNA表達明顯增強。經灰度軟件Quantity One掃描后，其RASSF1A /β-actin灰度值改變情況見表1。

表1 白藜蘆醇對胃癌細胞RASSF1A/β-actin mRNA灰度比值的影響（±s）

表1 白藜蘆醇對胃癌細胞RASSF1A/β-actin mRNA灰度比值的影響（±s）

注：abc分別與對照組比較，P值均＜0.01；10μM、20μM和40μM各組兩兩比較，P值均＜0.01。

白藜蘆醇濃度（μM） 重復次數（n） RASSF1A/β-actin（灰度值）0 3 0.09±0.02 10 3 0.24±0.04a 20 3 0.35±0.05b 40 3 0.47±0.04c F值 — 51.459

2.3 白藜蘆醇對胃癌細胞RASSF1A蛋白表達的影響

白藜蘆醇前，RASSF1A蛋白表達含量低，白藜蘆醇處理后，隨著濃度的增加，RASSF1A蛋白水平明顯升高。而內參β-actin在所有組中表達水平保持不變。見表2所示。

表2 白藜蘆醇對SGC-7901細胞RASSF1A/β-actin蛋白表達的影響（±s）

表2 白藜蘆醇對SGC-7901細胞RASSF1A/β-actin蛋白表達的影響（±s）

注：abc分別與對照組比較，P值均＜0.05；10μM、20μM和40μM各組兩兩比較，P值均＜0.05。

白藜蘆醇濃度（μM） 重復次數（n） RASSF1A/β-actin（灰度值）0 3 0.07±0.02 10 3 0.25±0.04a 20 3 0.41±0.06b 40 3 0.54±0.11c F值 — 27.225

3 討論

雖然根治性手術能大大提高早期胃癌患者的生存率[5]，但對于術后患者或已轉移的患者而言，化療依然是重要的治療手段。用于胃癌化療的藥物很多，但現有的藥物療效依然難以達到滿意的療效，因此開發和尋求新型治療藥物依然是當今臨床工作者不懈的追求。

隨著腫瘤分子生物學的發展，抑癌基因甲基化引起了學者們的廣泛關注。在眾多的抑癌基因當中，RASSF1A基因已成為當前研究的熱點，在胃癌患者中，RASSF1A啟動子區域甲基化的發生率可高達90%以上。抑癌基因甲基化導致其轉錄異常，從而可能引起細胞異常增殖。因此逆轉RASSF1A基因甲基化有望成為胃癌治療的重要途徑。

白藜蘆醇是一類非黃酮多酚類物質，是葡萄屬植物為抵抗外界刺激如紫外線、真菌、病毒感染或機械損傷而產生的一種植物抗毒素[6]。現代藥理學表明，白藜蘆醇除了具有抗炎、抗氧化、調節血脂等作用外，還能影響多條腫瘤相關途徑，從而抑制腫瘤細胞的生長[7]。在本研究當中，我們發現SGC-7901細胞靜息狀態下，細胞內可擴增出明顯的甲基化RASSF1A基因和非甲基化條帶，表明該細胞在正常狀態下部分RASSF1A基因處于甲基化狀態。當SGC-7901細胞與40μM白藜蘆醇孵育48h后，甲基化條帶明顯減弱，而非甲基化基因有所增加，表明白藜蘆醇能逆轉腫瘤細胞RASSF1A基因的甲基化狀態。隨后的研究也證實白藜蘆醇能在mRNA和蛋白水平增加RASSF1A基因的表達水平。

白藜蘆醇抑制RASSF1A基因甲基化的機制目前仍不甚明了，在DNA甲基化的過程中，甲基供體不足，或者通過去甲基化機制使腫瘤細胞重新激活抑癌基因可能是其作用的方式[8-9]，但這有待進一步研究?？傊?，本研究證實了白藜蘆醇的去甲基化效應，有望成為胃癌的輔助用藥。

[1]范東風.胃癌的癌前期病變與胃癌的早期診斷及治療[J].當代醫學,2011,17(12):102-103.

[2]劉培,姜相君,葛銀林.RASSF1A基因啟動子區甲基化在胃癌組織中的檢測[J]. 世界華人消化雜志,2009,17(30):3144-3147.

[3]任希才,姜相君.抑癌基因RASSF1A mRNA在胃癌中的表達及臨床意義[J].現代腫瘤醫學,2011,19(03):501-504.

[4]Kioulafa M,Kaklamanis L, Mavroudis D, et al. Prognostic significance of RASSF1A promoter methylation in operable breast cancer[J]. Clin Biochem, 2009,42(10-11):970-975.

[5]駱曦圖.全胃切除術治療胃癌27例臨床探討[J].當代醫學, 2011,17(09):64.

[6]樊慧婷,熊曉云,曹蔚,等.白藜蘆醇煙酸酯與白藜蘆醇體內外抗腫瘤作用比較[J].中國新藥雜志,2006,15(11):874-878.

[7]Gupta SC,Kannappan R,Reuter S,et al.Chemosensitization of tumors by resveratrol[J].Ann N Y Acad Sci,2011,1215(1):150-160.

[8]Mazue F,Colin D,Gobbo J,et al.Structural determinants of resveratrol for cell proliferation inhibition potency:experimental and docking studies of new analogs[J].Eur J Med Chem,2010,45(7):2972-2980.

[9]Jeong SH, Jo WS, Song S, et al.A novel resveratrol derivative, HS1793,overcomes the resistance conferred by Bcl-2 in human leukemic U937 cells[J].Biochem Pharmacol,2009,77(8):1337-1347.

Objective To investigate the effect of Resveratrol on RASSF1A methylation, mRNA and protein expression in Human gastric cancer SGC-7901. Methods The cultured SGC-7901 cells were incubated with 0,10μM,20μM,40μM of Resveratrol for 48h. After that, the changes of methylation in RASSF1A promoter region was determined by methylation-specif c PCR. The mRNA level of RASSF1A was detected by RT-PCR, and the protein level of RASSF1A was detected by Western blot. Results Resveratrol could inhibit SGC-7901 cells proliferation in dose-dependent manner. With increasing concentrations of Resveratrol, the level of methylation of RASSF1A gradually became weaker, while non-methylation of RASSF1A levels gradually increased. Both the mRNA and protein expression of RASSF1A levels can be signif cantly upregulated by Resveratrol. Conclusion Resveratrol can make demethylation of RASSF1A ,but not the upregulation of non-methylation expression , which may be one of the mechanisms of its antineoplastic activity.

Resveratrol;Human gastric cancer;Ras-association domain family 1

10.3969/j.issn.1009-4393.2011.18.013

421900 南華大學附屬第三醫院普外科 (黃明明 蔡衛東劉永輝)