星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化白茅根總酚酸提取工藝

劉榮華，陳石生，任剛，邵峰，黃慧蓮，楊明

(江西中醫(yī)學(xué)院現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室，江西南昌330004)

白茅根為禾本科植物白茅Imperata cylindricaBeauv.Var.major(Nees)C.E.Hubb.的干燥根莖，又名蘭根、地筋、白花茅根、茅草根、甜草根等，廣泛分布于全國各地，具有涼血止血、清熱生津、利尿通淋之功效［1］。白茅根酚酸類成分主要有tricin、jaceidin、quercetagetin-3，5，6，3＇-tetramethyl ether、3，5-Di-O-methyl-kaempferol、3-hydroxy-4-methoxy benzaldehyde、impecyloside、cylindol A B、graminones A B、imperanene、5-hydroxy-2-(2-phenylethyl)chromone、5-hydroxy-2-styrylchromone、5-hydroxy-2-［2-(2-hydroxyphenyl)ethyl］chromone、flidersiachromone［2-7］。藥理研究顯示白茅根中酚酸類成分具有血管舒張、血小板聚集抑制活性、抗氧化活性、細(xì)胞毒性、p-糖蛋白抑制活性、糖原磷酸化酶A抑制活性、抗炎活性、抗HBV病毒復(fù)制、神經(jīng)保護(hù)作用等生物活性［8-10］。因此，有必要對白茅根中酚酸類成分的提取工藝進(jìn)行研究。

本研究采用超聲波輔助提取法(Ultrasound-associated extraction，UAE)，在單因素考察的基礎(chǔ)上利用星點設(shè)計(central composite design，CCD)，通過三維效應(yīng)面(three dimensional response surface)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與擬合，優(yōu)化白茅根總酚酸的提取工藝，為白茅根中酚酸類成分的提取提供了依據(jù)。

1 材料

KQ-300DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);UV-2550型紫外分光光度計(日本Shimadzu公司);R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司);Sartorious BT 124S型萬分之一天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司);GZX-9070MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);高速中藥粉碎機(jī)(瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司);S-4藥典檢驗篩(浙江上虞市華康化驗儀器廠)。

白茅根于2010年3月采于江西中醫(yī)學(xué)院灣里校區(qū)，經(jīng)江西中醫(yī)學(xué)院賴學(xué)文教授鑒定為禾本科植物白茅Imperata cylindricaBeauv.Var.major(Nees)C.E.Hubb.的根莖，憑證標(biāo)本存于江西中醫(yī)學(xué)院標(biāo)本館。

沒食子酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110831-200803)，鐵氰化鉀、三氯化鐵、鹽酸、無水乙醇均為分析純，雙蒸水自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 白茅根總酚酸的測定

2.1.1 材料的處理將采挖的新鮮白茅根洗凈處理后置烘箱中60℃恒溫干燥，后用粉碎機(jī)粉碎，過藥典四號篩，－20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備參考文獻(xiàn)［11］，并作改進(jìn)，精密吸取19.70 μg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、2.80 mL于25 mL量瓶中，加入新鮮配制的0.10 mol/L三氯化鐵-0.008 0 mol/L鐵氰化鉀(1∶1)混合液1 mL，搖勻，暗處放置5 min，再用0.10 mol/L鹽酸定容至刻度，搖勻，暗處放置20 min，在波長695 nm處測定吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)y，沒食子酸質(zhì)量濃度x(μg/mL)為橫坐標(biāo)，得回歸方程為:y=0.291 1x+0.054 9，R2=0.998 5，線性范圍為0.039 33～2.200 8 μg/mL。

2.1.3 白茅根總酚酸的測定準(zhǔn)確稱取白茅根粉末2.0 g于100 mL具塞錐形瓶中，在一定料液比、溶劑濃度、溫度條件下超聲波輔助提取一定時間，取出過濾，濾液在40℃下減壓干燥，用適量60%乙醇分次溶解，定容至10 mL，取提取液0.3 mL，用60%乙醇定容至10 mL即得供試品溶液，取0.5 mL供試品溶液于10 mL量瓶中，按2.1.2項下方法測定吸光度，計算總酚酸量。每個實驗重復(fù)做3次，取平均

2.2 單因素試驗

2.2.1 乙醇對白茅根總酚酸提取效果的影響準(zhǔn)確稱取2.0 g白茅根干粉6份，置于100 mL平底燒瓶中，按料液比1∶20，分別加入30%、40%、50%、60%、70%、90%的乙醇，在40℃下超聲提取40 min，提取液按2.1.3項下方法處理并測定溶液中總酚酸，結(jié)果如圖1所示。

從圖1可以看出，低濃度乙醇提取時，總酚酸隨著乙醇質(zhì)量濃度的升高而增加，當(dāng)乙醇為50%時，總酚酸達(dá)到最大值，乙醇大于60%后，總酚酸明顯降低并處于相對平穩(wěn)狀態(tài)。因此，選擇50%作為白茅根總酚酸提取的最佳乙醇質(zhì)量濃度。

圖1 乙醇濃度對總酚酸提取效果的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction of total phenolics

2.2.2 提取時間對白茅根總酚酸提取效果的影響

按料液比1∶20，加入70%的乙醇，在40℃下分別超聲提取20、30、40、50、60、90 min，提取液按2.1.3項下方法處理并測定溶液中總酚酸，結(jié)果如圖2所示。

從圖2可以看出，提取時間為40 min時白茅根總酚酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，因此，選擇40 min作為白茅根總酚酸的最佳提取時間。

圖2 提取時間對總酚酸提取效果的影響Fig.2 Effect of extracting time on extraction of total phenolics

2.2.3 提取溫度對白茅根總酚酸提取效果的影響

按料液比1∶20，加入70%的乙醇，分別在20、30、40、50、60、70℃下超聲提取40 min，提取液按2.1.3項下方法處理并測定溶液中總酚酸，結(jié)果如圖3所示。

從圖3可以看出，在提取溫度為20℃時可得到較高的白茅根總酚酸，其后總酚酸隨著溫度的升高而下降，當(dāng)溫度為50℃時降到最低，而后又有所上升。考慮到酚酸類物質(zhì)在較高溫度下易被破壞，故選擇20℃作為最佳提取溫度。

圖3 提取溫度對總酚酸提取效果的影響Fig.3 Effect of extracting temperature on extraction of total phenolics

2.2.4 料液比對白茅根總酚酸提取效果的影響原料按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50加入70%乙醇，在40℃條件下超聲提取40 min，提取液按2.1.3項下方法處理并測定溶液中總酚酸。結(jié)果如圖4所示。

從圖4可以看出，隨著料液比的增加，總酚酸顯著增加，達(dá)到1∶40后再增大料液比時，總酚酸反而降低，過大的溶劑用量會造成浪費，并給一些后續(xù)工作如:過濾、濃縮等帶來麻煩，因此選擇料液比為1∶40。

圖4 料液比對總酚酸提取效果的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on extraction of total phenolics

2.3 星點設(shè)計試驗

2.3.1 因素、水平及指標(biāo)的確定在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，料液比固定用1∶40，選取乙醇質(zhì)量濃度、提取時間、提取溫度作為考察對象，采用Design Expert 7.0統(tǒng)計分析軟件，以總酚酸為響應(yīng)值，進(jìn)行效應(yīng)面法優(yōu)化試驗，以獲取最佳參數(shù)。試驗因素和水平安排見表1。

2.3.2 表2進(jìn)行提取，按照2.1.3項下處理方法及2.1.2項下測定方法，測定白茅根總酚酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表2。

表1 因素與水平Tab.1 Factors and levels of response surface methodology

表2 星點試驗設(shè)計與結(jié)果Tab.2 The plan and results for response surface methodology

2.3.3 模型的建立及其顯著性檢驗利用Design Expert 7.0統(tǒng)計軟件通過逐步回歸表2實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到總酚酸對以上3個因素的二次多項回歸方程為:

Y=2.646－0.386 81A+0.180 77B+0.359 54C+0.001 739 13AB－0.000 436 625AC－0.000 250 625BC+0.003 239 9A2－0.003 201 09B2－0.005 061 59C2

對該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。表3顯示模型具有高度的顯著性(P＜0.01)，失擬項不顯著以及R2=0.887 6，可知方程擬合度和可信度均良好，試驗誤差小，故可用此模型對白茅根總酚酸的提取工藝進(jìn)行分析和預(yù)測。

2.3.4 應(yīng)曲面圖，考察所擬合的響應(yīng)曲面形狀，分析乙醇質(zhì)量濃度、提取時間和提取溫度對白茅根總酚酸的影響。其響應(yīng)面圖見圖5～7，3組圖直觀地反映了各因素對響應(yīng)值的影響。

表3 方差分析Tab.3 Analysis of mean square deviation of regress equation

圖5 乙醇質(zhì)量濃度、提取時間及其相互作用對總酚酸影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Correlative effects of ethanol concentration and time

圖6 乙醇質(zhì)量濃度、提取溫度及其相互作用對總酚酸影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Correlative effects of ethanol concentration and temperature

比較3組圖并結(jié)合表3中p可知:C的一次項、AB、A2、B2、C2對總酚酸影響顯著，表明各影響因素對總酚酸得率的影響不是簡單的線性關(guān)系。

圖7 提取時間、提取溫度及其相互作用對總酚酸影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Correlative effects of extracting time and temperature

為進(jìn)一步確定最佳提取工藝參數(shù)，基于已建立的數(shù)學(xué)模型，對總酚酸進(jìn)行最優(yōu)化設(shè)計，得到白茅根中總酚酸的提取條件為:乙醇濃度為40%，提取時間38 min，提取溫度為33℃，料液比為1∶40。白茅根總酚酸的預(yù)測值為2.71 mg/g。

2.3.5 驗證試驗為檢驗實驗方法的可靠性，在優(yōu)化條件下，進(jìn)行3次平行試驗驗證，得到白茅根總酚酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.46 mg/g，與預(yù)測值接近，說明此模型可靠。因此，基于星點設(shè)計所得的最佳工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實用價值。

3 討論

超聲波輔助提取法(UAE)是采用超聲波輔助溶劑進(jìn)行提取，聲波產(chǎn)生高速、強(qiáng)烈的空化效應(yīng)和攪拌作用，破壞植物藥材的細(xì)胞，使溶劑滲透到藥材細(xì)胞中，縮短提取時間，提高提取率。該法所需設(shè)備簡單，操作方便，比一般提取技術(shù)更加有效，超聲過程中所需提取溫度較低，故可以防止目標(biāo)成分可能的化學(xué)降解［12］，而溫度過高會加速酚性成分的氧化分解，所以UAE更加適合酚酸類成分的提取。

星點設(shè)計(CCD)是在析因設(shè)計的基礎(chǔ)上，加上星點及中心點而形成的實驗次數(shù)較少、可采用三維效應(yīng)面(three dimensional response surface)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與擬合的實驗設(shè)計方法［13］，已在藥物提取和處方工藝的優(yōu)化中有一定的應(yīng)用［14-16］。本實驗在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化白茅根總酚酸的提取工藝，可為白茅根中酚酸類成分的提取提供依據(jù)，這對于進(jìn)一步研究白茅根酚酸類成分具有重要意義。

由單因素試驗和星點試驗設(shè)計及其分析結(jié)果獲得的超聲輔助提取白茅根總酚酸的最佳工藝為乙醇濃度為40%，提取時間38 min，提取溫度為33℃，料液比為1∶40。該工藝總酚酸的預(yù)測值的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.71 mg/g，驗證實驗總酚酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.46 mg/g。本研究結(jié)果是在實驗室小試基礎(chǔ)上獲得的，還有待在放大實驗中進(jìn)一步驗證。

［1］國家中醫(yī)藥管理局.中華本草:第八冊［M］.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，1999:357-360.

［2］Mohamed G A，Ahmed A L，F(xiàn)ouad M A，et al.Chemical composition and hepato-protective activity ofImperata cylindricaBeauv.［J］.Phcog Mag，2009，4(17):28-36.

［3］Lee D Y，Han K M，Song M C，et al.A new lignan glycoside from the rhizomes ofImperata cylindrica［J］.J Asian Nat Prod Res，2008，10(4):299-302.

［4］Matsunaga K，Shibuya M，Ohizumi Y，et al.Cylindol A，a novel biphenyl ether with 5-Lipoxygenase inhibitory activity，and a related compound fromImperata cylindrica［J］.J Nat Prod，1994，57(9):1290-1293.

［5］Matsunaga K，Shibuya M，Ohizumi Y，et al.A novel lignan with vasodilative activity fromImperata cylindrica［J］.J Nat Prod，1994，57(12):1734-1736.

［6］Matsunaga K，Shibuya M，Ohizumi Y.Imperanene，A novel phenolic compound with platelet aggregation inhibitory activity fromImperata cylindrica［J］.J Nat Prod，1995，58(1):138-139.

［7］Yoon J S，Lee M K，Sung S H，et al.Neuroprotective 2-(2-Phenylethyl)chromones ofImperata cylindrica［J］.J Nat Prod，2006，69(2):290-291.

［8］Jeong Y H，Chung S Y，Han A R，et al.P-Glycoprotein inhibitory activity of two phenolic compounds，(-)-syringaresinol and tricin fromSasa borealis［J］.Chem Biol，2007，4(1):12-16.

［9］Jakobs S，F(xiàn)ridrich D，Hofem S，et al.Natural flavonoids are potent inhibitors of glycogen phosphorylase［J］.Mol Nutrition Food Res，2006，50(1):52-57.

［10］Moscatelli V，Hnatyszyn O，Acevedo C，et al.Flavonoids fromArtemisia copawith anti-inflammatory activity［J］.Planta Med，2006，72(1):72-74.

［11］付煜榮，張萬明，陳桂敏，等.景天三七中沒食子酸和總酚酸含量測定［J］.中成藥，2006，28(7):1016-1018.

［12］Wang L，Weller C L.Recent advances in extraction of nutraceuticals from plants［J］.Trends Food Sci Technol，2006，17(6):300-312.

［13］吳偉，崔光華.星點設(shè)計-效應(yīng)面優(yōu)化法及其在藥學(xué)中的應(yīng)用［J］.國外醫(yī)學(xué)·藥學(xué)分冊，2000，27(5):292-298.

［14］孫磊，王玉蓉.星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)選遠(yuǎn)志的提取工藝［J］.中成藥，2006，28(3):328-331.

［15］黃健，高春生，單利，等.星點設(shè)計-效應(yīng)面法在酒石酸美托洛爾緩釋微丸處方優(yōu)化中的應(yīng)用［J］.中國藥學(xué)雜志，2007，42(7):512-515.

［16］王國華，張保獻(xiàn)，聶其霞，等.星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)選荷葉中荷葉堿與荷葉黃酮的提取工藝［J］.中國中藥雜志，2008，33(20):2332-2335.