綿羊Hoxc8與d11基因甲基化的量子力學特征與功能

趙 靜 ，張立嶺 ，2，巴 圖 ，陳 琦

（1.內蒙古農業大學動物科學學院，呼和浩特 010018；

2.海南大學動物科學系，海口 570228；3.內蒙古農牧科學院畜牧研究所；4.內蒙古醫學院）

綿羊Hoxc8與d11基因甲基化的量子力學特征與功能

趙 靜1，張立嶺1，2，巴 圖3，陳 琦4

（1.內蒙古農業大學動物科學學院，呼和浩特 010018；

2.海南大學動物科學系，海口 570228；3.內蒙古農牧科學院畜牧研究所；4.內蒙古醫學院）

文章研究了蒙古羊和德國美利奴肉羊、陶賽特肉羊、澳洲美利奴細毛羊的Hoxc8和Hoxd11基因及其第1位外顯子的甲基化位置、數量、穩定程度，以及甲基化的量子力學性質。與蒙古羊相比，內含子序列有數個堿基的差異，外顯子一致。外顯子序列的甲基化在轉錄和翻譯過程中的功能，與甲基化導致的分子軌道和量子力學變化有關。甲基化胞嘧啶在密碼與反密碼中的第2位，決定甲基化是否對轉錄和翻譯產生效應。蒙古羊14枚胸椎個體的父本Hoxc8 exon-1和Hoxd11 exon-1序列甲基化程度高，母本的甲基化程度低；13枚胸椎個體的父本和母本相應序列的甲基化程度都低。

綿羊；Hoxc8和d11；甲基化；量子力學；分子軌道

高等生物的基因組包含數以萬計的基因，基因的功能千差萬別。雖然許多物種的全基因組已經完成測序，許多功能基因已經克隆定位，部分基因與性狀的關系已經明確，但是大部分基因的序列特征與基因表達之間的聯系還不完全清楚。動物群體中的許多功能基因的序列幾近完全相同，但處于特定位置和特定堿基環境中（例如CpG）C的甲基化（C→5mC），卻產生了表觀遺傳和基因組印記等遺傳和表型效應。這些現象是無法用傳統的基因序列差異（突變）來解釋的。迄今為止，還不能應用生物化學、分子遺傳學等完全揭示胞嘧啶第5位碳原子甲基化產生表觀遺傳效應的機理［1］。而量子力學的理論、技術和方法為揭示生物表觀遺傳現象提供了新的思路。

量子力學方法早就被用來解釋DNA結構與功能之間的關系。Müller等于1927年發現X射線照射果蠅能導致遺傳突變［2］。后來，Jordan（1930）提出基因突變是一種量子過程的論斷。Bohr則認為，對于生命現象的了解以及揭示生命的遺傳現象，需要量子力學的波粒特性［3］。Delbrück研究了基因與突變的關系，發現量子力學理論與遺傳突變學說之間有密切的相似性［4］。Schr?dinger根據量子力學理論和遺傳學研究成果，提出用“量子躍遷”來解釋基因突變以及遺傳性狀以“密碼”形式通過染色體而傳遞等現象［5］。這些論斷已被華生和克里克提出的DNA雙螺旋結構模型和遺傳密碼所證實。DNA分子中的胞嘧啶的甲基化所隱藏的信息，同樣可以利用分子軌道理論和量子力學方法解釋。因此，本研究以蒙古羊、德國美利奴羊、陶賽特羊、澳洲美利奴（澳美）羊為實驗對象，研究了它們的Hoxc8與d11基因的甲基化及其量子力學特征。

1 材料與方法

在2007—2010年間，在內蒙古錫林郭勒盟的東烏珠穆沁旗、正藍旗分別采集200只成年蒙古羊（種公羊20只，種母羊180只）及其后代血樣。在正藍旗采集100只德國美利奴羊、陶賽特羊、澳美羊等種公羊、種母羊及其羔羊的血樣，ACD抗凝，液氮凍存。羔羊在5～6月齡屠宰，并確認脊椎數。用基因組DNA提取試劑盒（Promega，A1120）提取綿羊基因組DNA。按照課題組前期實驗結果［6-8］和NCBI的GenBank的相應基因序列設計PCR引物，擴增目標序列。測序后，與已知物種序列比對，分析目標基因及其外顯子（exon）和內含子（intron）的CpG的數量、位置、密度等。設計針對亞硫酸氫鹽處理后序列的PCR引物以及專門的PCR擴增條件。用亞硫酸氫鹽轉化試劑盒（EpiTect Bisulfite Kit，59104）對目標序列進行亞硫酸氫鹽處理并克隆測序，確定甲基化胞嘧啶（5mC）的位置和數量。

胞嘧啶（C）和甲基化胞嘧啶（5mC）的量子力學特征分析主要利用薛定諤（Schr?dinger）波動方程、Pauling的雜化軌道和共振理論及其相關的計算方法和結果。HMO法是Hückel根據經驗提出的處理π電子體系的近似方法，主要用于π電子體系，例如嘌呤和嘧啶。根據分子內的共軛原子的電子軌道線性組合假設，建立Hückel矩陣，用迭代法計算矩陣方程的特征值和特征向量。再按照理論指數計算公式，得到胞嘧啶的相應理論參數［9-10］。

其中，ai=∫ФiHФidr為第i個原子的Coulomb積分，取碳原子C的ac=0，βij=∫ФiHФidr為第i個原子和第j個原子的共振積分。在HMO理論中，令不相鄰原子之間的共振積分為零。δi為第i個雜原子的Coulomb積分經驗參數，ηij是第i和第j原子之間的共振積分經驗參數。胞嘧啶分子的secular行列式為：

其中，C是特征向量（波函數）矩陣，每列代表由原子軌道組成的分子軌道分量，ψi=ΣCivФv。λ是特征值λi的對角陣，λi為分子軌道能級。

2 結果與討論

2.1 胞嘧啶分子的雜化軌道及其量子特征 國內外的許多研究表明，胞嘧啶第2位的C=O（sp2雜化軌道，σ+π鍵）的解離能為6.30 eV或608 KJ/mol，第4位的C-N（sp2雜化軌道，σ鍵）的解離能為3.03 eV或292 KJ/mol，第5位C-C（sp3雜化軌道，σ鍵）的解離能為2.55 eV或246 KJ/mol。胞嘧啶的甲基的解離能大大低于C-N和C=O的解離能，因此，胞嘧啶第5位的C要比C-N和C=O易于解離或附著甲基。胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的最高占據分子軌道（即電離勢，highest ocupied molecular orbital，HOMO）分別為 0.60 β 和 0.53 β，二者的最低空分子軌道（即電子親合勢，lowest unocupied molecular orbital，LEMO）均為-0.80［9］。這表明，C 和 5mC 的電子的量子特征的變化不大，不至于影響堿基配對和堿基堆積。

脊椎動物的5mC含量約為0.1～3.0 mol%，而且呈180°旋轉對稱。一個甲基（CH3）的3個σ鍵各自形成以C-H為對稱軸的電子云。5mC第5位的C與甲基的C形成一個σ鍵。所以，5mC分子與胞嘧啶分子相比，多了4個σ鍵。由于5mC的17個原子也和C的13個原子一樣，都處于同一個平面上，所以，多出的4個σ鍵在空間結構上并不干擾DNA分子單鏈之間堿基的配對和單鏈內相鄰堿基的堆積。

2.2 甲基化胞嘧啶在遺傳密碼中的位置及其功能 5-甲基胞嘧啶的生物功能并非體現在DNA雙螺旋結構上，而是表現在從DNA轉錄到RNA，以及從mRNA到tRNA的過程。

5mC可能出現在mRNA密碼和tRNA反密碼的1～3之間的任何位置。由于5mC全都以CG形式出現，所以，在密碼和反密碼的3聯堿基中，只有2類CG組合：CG在密碼堿基的第 1～2 位，包括 CGU、CGC、CGA、CGG；CG在密碼堿基的第 2～3 位，UCG、CCG、ACG、GCG。這兩類密碼組合的堿基的親水力、堿基堆積力、π鍵能及分子量都基本相同［10］。但是，密碼的5mCG的靜電能，極化能，色散能，排斥能，總能的絕對值都高于CG的相應值，特別是后三項更大［11］。這種分子之間作用力的增加，意味著密碼在識別和選擇反密碼的能力上產生差別，客觀上具有新增密碼種類的效果。這應該是5-甲基胞嘧啶生物學功能上有別于胞嘧啶的物理原因。

由于密碼的第2位堿基專一性最強，決定密碼的生物學意義，即決定氨基酸的性質及其對蛋白質空間結構［12］。考慮到密碼第1位堿基嚴格，反密碼第1位堿基也嚴格，二者反向互補，所以，mRNA密碼的嚴格堿基對應tRNA反密碼的變偶堿基，而tRNA的反密碼的嚴格堿基對應mRNA密碼的變偶堿基。最終的結果還是第2位堿基起決定性作用。這就是密碼第2位堿基決定密碼和反密碼之間的締合能，決定密碼的特異性，也決定密碼所對應的氨基酸的性質及其對蛋白質空間結構的內在的根本原因。

而處于密碼第2位的5mC只占5mC的一定比例。這個推斷可以滿意地解釋為什么有一部分甲基化與表觀遺傳沒有必然聯系的原因。這也是研究5mC功能區的必要性和重要性所在。由于這種類型的C處于密碼和反密碼的變偶位置，所以，在轉錄和翻譯過程中，是否甲基化的意義不大，可以忽略。因此，僅僅確定DNA序列中的甲基化位點的數量，并不能圓滿解釋甲基化與表觀遺傳之間的聯系。

胞嘧啶的甲基化修飾，在DNA甲基轉移酶（DNA methyl-transferase，Dnmt）催化下，經過一步反應即可完成［13］。真核DNA的甲基化，轉錄為mRNA后參與表觀遺傳性狀表達，而mRNA則參與細胞的精細調節［14］。因此，核酸堿基的甲基化具有明確的功能性。DNA的5mC轉錄為mRNA后仍然保持甲基化。mRNA的密碼與tRNA反密碼結合時，胞嘧啶與甲基化胞嘧啶之間的量子力學特征上的差異，決定tRNA選擇哪種氨基酸，從而產生表觀遺傳作用。

5mC的C5位上的CH3，其C-C偶極矩也極小，僅為0.36 D，所以不改變C的疏水性。嘧啶堿基之間的合成或代謝方向為C→5mC，C→U（RNA），U→T。在胞嘧啶脫氨基酶的催化下，胞嘧啶先水解脫氨基，生成尿嘧啶。胞嘧啶經過甲基化酶作用轉化為5-甲基胞嘧啶，然后脫氨基后轉化為胸腺嘧啶。這個反應是不可逆的。這就保證了5-甲基胞嘧啶的穩定性和遺傳信息改變以后的可持續性。

2.3 綿羊Hoxc8與Hoxd11的CpG密度 通過引物8-F1（5’TACCCAGCATGAGCTCCTACTTCGT 3’），8-R1（5’CTCGGAACTTTTCGCTGTGTCT 3’） 和引物 11-F1（5’CTCTTGTGCAATCGATGGCT 3’），11-R1（5’GAAGAGGCGTCATTAAACCCAAGGA 3’）得到目標基因Hoxc8和Hoxd11 基 因 ， 并 提 交 GenBank（Hoxc8，GU479925；Hoxd11，GU059862）。

草食動物功能基因組中的CpG的數量和分布及其甲基化與表觀遺傳性狀的研究剛剛起步。目前已經研究的功能基因主要是調控綿羊脊椎發育的Homeobox基因家族中的 Hoxc8 和 Hoxd11［6-8］。

綿羊 Hoxc8基因全長 2 107 bp，exon-1為 436 bp，exon-2為293 bp，intron為1 378 bp。exon-1的G+C含量61.01%，A+T含量38.99%，共有35個CpG。其中位于密碼第1～2位的CpG共2個，全部編碼精氨酸。位于密碼的第2～3位的CpG共13個，3～1位的密碼子占20個。Hoxc8基因exon-2序列中，G+C含量45.8%，低于A＋T的含量54.2%。CpG含量少（12個），分布稀疏。

綿羊Hoxd11基因全長1 772 bp，其中exon-1為778 bp，exon-2 為 236 bp，內含子為 758 bp。exon-1 序列 C+G=76.74%。而A+T僅有23.26%，共有120個CpG，其中位于密碼第1～2位的CpG共8個，全部編碼精氨酸。位于密碼的第2～3位的CpG共47個，3～1位的密碼子占65個。Exon-2序列中C+G=47.03%，低于A+T的含量52.97%，只有12個CpG，而且分布分散，所以，本文重點討論Hoxc8和Hoxd11 exon-1序列及其CpG。

德國肉用美利奴羊、陶賽特羊、澳美羊等國外綿羊品種的Hoxc8和Hoxd11的兩個外顯子序列都相同，但是，在這兩個外顯子之間的內含子序列中，有數個堿基的差異。這個差異應該屬于遺傳多樣性，或者中性突變，對基因的表達沒有影響。

蒙古羊與德國肉用美利奴羊，陶賽特羊正反交結果表明，蒙古羊的多脊椎特征可以按照表觀遺傳方式，遺傳給雜交后代（5%～10%）。但是，雜交后代的尾形介于兩個親本之間，即蒙古羊的脂尾和國外品種的細長尾屬于等顯性。

2.4 蒙古羊Hoxc8的甲基化特征 研究表明，蒙古羊的Hoxc8 exon-1中的5mC的數量（或比例）和位置，與胸椎數是13，還是14枚有關。14胸椎蒙古羊和13胸椎蒙古羊的Hoxc8exon-1中的甲基化比例分別為（6.26±4.00）%，（0.54±0.50）%（P=0.017＜0.05）［6］。在甲基化位置上，也有明顯差異，14胸椎蒙古羊的甲基化位點密集（都含有一段連續6個甲基化胞嘧啶的區域）。相比之下，13個胸椎蒙古羊的相同序列區間內的甲基化位點分散，不存在甲基化密集區，甲基化胞嘧啶在密碼中的位置沒有規律。所以，甲基化的比例是個定性的，總體的差異，而甲基化的分布密度，甲基化胞嘧啶在密碼內的位置，是導致表觀遺傳效應的關鍵因素。

這些測定結果表明，在功能基因序列中，單個的和分散的甲基化胞嘧啶雖然在量子力學參數方面有一定的變化，但是還不足以導致可觀察到的表型差異。因此，不能簡單地根據甲基化胞嘧啶的數量來推斷其功能意義。相反，功能基因序列中存在的多個且集中的甲基化胞嘧啶，特別是在遺傳密碼第2位胞嘧啶的甲基化，其密集分布所產生的量子力學效應的疊加，才能產生可以觀察到的表觀遺傳效應。所以，胞嘧啶甲基化具有量化的累積效應，而不是簡單的定性效應。

蒙古羊Hoxc8 exon-1的甲基化具有明顯的基因組印記或表觀遺傳特征。已經得到的測定結果證實，蒙古羊每個個體的Hoxc8 exon-1中甲基化數量、位置是不固定的，有的多，有的少。這是明顯的表觀遺傳特征，即基因中的目標序列的甲基化程度，與這個序列來自父本或母本有關。對于蒙古羊來說，14枚胸椎個體的父本序列甲基化程度高，母本的甲基化程度低。相比之下，蒙古羊中的13枚胸椎個體，其父本和母本的相應序列的甲基化程度都低。所以，通過測定活體羊的Hoxc8 exon-1甲基化數量或比例，容易識別這只羊是13還是14枚胸椎，從而達到早期選種的目的。

3 結論

雖然目前的量子力學方法還不能滿足DNA/RNA核苷酸或者堿基的結構與功能分析的需要，也不可能替代實驗室的儀器分析，但是，結合分子遺傳實驗結果，基本上能夠肯定，基因的信息就是堿基和密碼的電子信息和能量信息，而且能夠進行量子化的定量描述。這些信息的波粒特征和能量特征，具有穩定性和傳遞性，特異性和相干性，具備了遺傳信息應具備的所有條件。遺傳學從Mendel的家系水平的性狀的經典遺傳學，經過Morgan時代的染色體水平的細胞遺傳學，到Watson-Crick為代表的分子遺傳學，一直發展到目前日漸端倪的量子遺傳學，預示著遺傳學的發展趨勢和方向。量子力學理論與方法有助于表觀遺傳機制的理解，也有助于解釋基因序列甲基化的功能。

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The Quantum Mechanics and the Functions of DNA Methylation of Hoxc8 and Hoxd11 in Sheep

Zhao Jing1，Zhang Li-ling1，2，Batu3，et al
（1.College of Animal Science，Inner Mongolia Agriculture University，Huhhot 010018，China；
2.Department of Animal Sciences，Hainan University，Haikou 570228，China；et al）

The Hoxc8 and Hoxd11 genes among Dorset，German Merino，Australia Merino and Mongolia sheep，and the methylation position and density of exon-1 CpGs were determined.For Hoxc8 and Hoxd11 exons in German Merino，Dorset，Australia Merino，there were no different from that of Mongolia sheep，but several differences in the intron for these breeds.The exon-1 sequence of the function genes was related to the quantum mechanics of the molecular orbit（MO）of DNA methylation.The positions and the numbers of methylated cytosine in the second codes and anti-codes of the genes decided the effects of the DNA methylation on the transcription and translation.The methylation rate from rams of 14 thoracic vertebrae Mongolia sheep were higher，and the ewes were lower，but the methylation rate from the parents of 13 thoracic vertebrae Mongolia sheep were both lower.

sheep；Hoxc8 and d11；methylation；quantum mechanics；MO

2011-03-11

國家自然科學

（30960245）

趙靜（1982-），女，博士研究生。

張立嶺，男，內蒙古農業大學和海南大學教授。Email：nmglilingzhang@126.com

1007-9726（2011）03-0005-04

S826.1