對(duì)1株疑似鼠疫耶爾森氏菌的系統(tǒng)鑒定

何 建,李艷君,祁芝珍,崔玉軍,任玲玲,代瑞霞,王效義,崔百忠,張青雯,楊瑞馥,宋亞軍

鼠疫是一種嚴(yán)重危害人類健康的人獸共患病。鼠疫菌是鼠疫的病原體,為革蘭陰性菌,屬于腸桿菌科的耶爾森氏菌屬。比較基因組學(xué)研究表明,鼠疫菌在大約1 500-20 000年前由假結(jié)核耶爾森氏菌(以下簡(jiǎn)稱假結(jié)核菌)進(jìn)化而來[1-2]。作為一個(gè)相對(duì)“年輕”的病原細(xì)菌,鼠疫菌的生物學(xué)特征以及基因組結(jié)構(gòu)均與其“祖先”—假結(jié)核菌極為相似。

在我國(guó)鼠疫防治實(shí)踐中,“四步檢驗(yàn)”(形態(tài)、鏡檢、噬菌體裂解以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn))一直都是鼠疫菌鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)”[3]。而由于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的成本較高,周期較長(zhǎng),噬菌體裂解實(shí)際上成為許多一線鼠疫防治機(jī)構(gòu)進(jìn)行鼠疫菌鑒定的重要依據(jù)。2005年,我們?cè)谶M(jìn)行菌株凍干入庫前的動(dòng)物試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)菌株55023能夠被鼠疫噬菌體裂解,但是不能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的死亡。因此,我們對(duì)該菌株進(jìn)行了系統(tǒng)的表型和分子生物學(xué)鑒定,以確定其是否為鼠疫菌。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 被試菌株55023,對(duì)照菌株為鼠疫菌標(biāo)準(zhǔn)株 141、91001、82009,以及假結(jié)核菌 Ⅰ型 5號(hào)(PTB),由青海省地方病預(yù)防控制所鼠疫菌保藏中心提供;染色體DNA均用傳統(tǒng)的苯酚-氯仿法提取。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明系小白鼠體重18～20g,由青海省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3 主要試劑及儀器 鼠疫噬菌體、各類鑒定培養(yǎng)基均由青海省地方病預(yù)防控制所鼠疫室提供。鼠疫菌FI抗原、抗體檢測(cè)試劑由北京莊笛浩禾生物醫(yī)學(xué)科技有限公司提供。TaqDNA聚合酶和dNTP購自大連 TaKaRa生物技術(shù)公司;GoldviewTMDNA染料由賽百盛公司提供;PCR擴(kuò)增在MJ-25全自動(dòng)PCR儀上完成。

1.4 引物 各項(xiàng)基因檢測(cè)用引物均由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所提供,引物序列詳見表1。

1.5 鼠疫噬菌體裂解試驗(yàn) 被試株55023和對(duì)照株141、PTB劃線接種于固體培養(yǎng)基,滴加鼠疫噬菌體,使其流過劃線區(qū)域,將培養(yǎng)皿分別置于22℃、28℃、37℃過夜培養(yǎng),觀察有無噬菌現(xiàn)象;以鼠疫菌141菌株和假結(jié)核菌PTB為對(duì)照。

1.6 生化及糖醇類酵解試驗(yàn) 按常規(guī)試管法[4]對(duì)55023菌株進(jìn)行阿膠糖、鼠李糖、麥芽糖、脫氮、蜜二糖、甘油等生化試驗(yàn),觀察14d。

1.7 毒力因子檢查及結(jié)果判定 按常規(guī)法[5]測(cè)試55023菌株的 F1抗原(F1),VW抗原(VW),色素沉著表型(Pgm)以及鼠疫菌素(Pst I)等毒力因子表型。

1.8 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 按 50、100、150、200、250、300、350億個(gè)菌/mL設(shè)置劑量組,每組5只動(dòng)物,鼠鼷部皮下接種0.5 mL,分籠飼養(yǎng)觀察14d,若動(dòng)物死亡,取其肝、脾、肺、心、腺均進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng),14d后仍未死亡的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物全部處死,觀察病理變化,每只動(dòng)物均取肝、脾、肺、心、腺進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng),并利用膠體金試劑盒進(jìn)行鼠疫抗原和鼠疫抗體檢查[6]。

表1 基因檢測(cè)用引物及序列Table 1 The sequences of primers for gene validation

1.9 鼠疫菌全基因組芯片雜交 以55023菌株DNA為測(cè)試方,以91001和82009菌株DNA的等量混合物為參考方,進(jìn)行全基因組芯片雜交分析,方法參見文獻(xiàn)[7]。

1.10 PCR擴(kuò)增 用鼠疫菌標(biāo)識(shí)基因[8]、質(zhì)粒檢測(cè)基因、色素沉著位點(diǎn)pgm代表性基因的特異引物對(duì)該菌株DNA進(jìn)行擴(kuò)增(表1),以91001菌株作為陽性對(duì)照,同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照。擴(kuò)增條件為:95℃預(yù)變性3min,30個(gè)循環(huán)(95℃變性40s,56℃復(fù)性40s,72℃延伸60s),72℃終延伸5min。產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳,GoldviewTM染色,紫外燈下記錄結(jié)果。

1.11 鼠疫菌差異片段(Different Region,DFR)分型 用23對(duì)DFR(DFR01-DFR23)分型引物[9],對(duì)該株菌樣品DNA進(jìn)行分型驗(yàn)證,以91001、82009菌株DNA的等量混合物為陽性對(duì)照,同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照。

1.12 多位點(diǎn)序列分型(Multi-Locus Sequence Typing,MLST)分析 根據(jù)文獻(xiàn)[1],選擇dmsA,glnA,manB,thrA,tm K,trp六個(gè)看家基因的特異引物對(duì)該菌株進(jìn)行擴(kuò)增,產(chǎn)物測(cè)序后進(jìn)行序列比對(duì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 培養(yǎng)特性和鏡下形態(tài) 55023菌株培養(yǎng)于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,28℃、37℃培養(yǎng)24h后生長(zhǎng)良好;肉眼觀察呈灰色小菌落,低倍顯微鏡下可見菌落中央為黃褐色,有粗糙顆粒,邊緣有薄而透明、鋸齒狀花邊;與典型的鼠疫菌形態(tài)無顯著性差異。55023菌株革蘭氏染色陰性,鏡下呈兩端鈍圓,兩極濃染的短小桿狀 ,長(zhǎng)約 1～2μm,寬約 0.5～0.7μm,無鞭毛,無芽孢;具備典型的鼠疫菌鏡下形態(tài)。

2.2 鼠疫噬菌體裂解試驗(yàn) 55023菌株和141菌株在22℃、28℃以及37℃不同的培養(yǎng)溫度下,均能被鼠疫噬菌體完全裂解,呈清晰的噬菌帶;而假結(jié)核菌參考菌株P(guān)TB在3個(gè)溫度下均無噬菌帶。

2.3 生化特性和毒力因子 55023的主要代謝表型為,阿膠糖(+),鼠李糖(-),麥芽糖(+),蜜二糖(-),甘油(+),脫氮(+),與鼠疫菌141菌株特征完全一致。其毒力因子表型為F1(-),VW(-),Pgm(-),PstⅠ(-),四個(gè)毒力因子均為陰性,不符合鼠疫菌的特征。

2.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 55023菌株接種小白鼠后,14 d內(nèi)所有劑量組共計(jì)35只小白鼠均無死亡;14 d后全部處死,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物臟器中未看到有明顯病理變化,取肝、脾、肺、心、腺均做細(xì)菌培養(yǎng),結(jié)果為陰性;利用鼠疫膠體金試劑盒未檢測(cè)到鼠疫菌FI抗原和抗體。

2.5 鼠疫菌全基因組芯片雜交 全基因組芯片雜交結(jié)果表明,在4 105個(gè)測(cè)試的基因中,55023菌株基因組中缺失了489個(gè)基因,約占芯片所有基因的12%。其中鼠疫菌的 3個(gè)質(zhì)粒(pPCP,pCD和pMT1)全部缺失,染色體上缺失的主要基因片段有YPO2087-2135、YPO0685-0778、YPO0980-1012 及YPO2271-2281等。

2.6 PCR擴(kuò)增結(jié)果 該菌株用鼠疫菌標(biāo)識(shí)基因YPO0392和 YPO1091的特異引物擴(kuò)增結(jié)果為陰性,對(duì)于鼠疫菌質(zhì)粒的6個(gè)基因,該株菌樣品均無擴(kuò)增產(chǎn)物,pgm位點(diǎn)的代表基因 YPO1954擴(kuò)增陽性,而 YPO1908擴(kuò)增陰性,以上擴(kuò)增反應(yīng)對(duì)照菌株91001的DNA均有預(yù)期產(chǎn)物,空白對(duì)照成立。

2.7 DFR分型 結(jié)果見表 2,在 23個(gè) DFR中55023菌株缺失了14個(gè),檢索包含900余株鼠疫菌自然分離菌株的DFR分型數(shù)據(jù)庫[9],未發(fā)現(xiàn)與其一致或相類似的基因組型。

表2 55023菌株的DFR分型結(jié)果Table 2 The DFR profiles of strain 55023

2.8 MLST結(jié)果 測(cè)序的6個(gè)看家基因片段共2,509 bp,經(jīng)檢索NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫,55023菌株與鼠疫菌的序列共存在16個(gè)堿基的差異,而與假結(jié)核菌血清Ⅲ型 IP32937菌株僅存在兩個(gè)堿基的差異,其中4個(gè)基因完全一致,詳見表3。

3 討 論

噬菌體裂解試驗(yàn)是原鼠疫診斷國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB15991-1995)中病原學(xué)檢測(cè)的重要內(nèi)容。從自然界分離的某些假結(jié)核菌能夠在37℃或30℃被鼠疫噬菌體裂解,但是在20～22℃不被裂解,這種溫度特異性裂解是利用鼠疫噬菌體進(jìn)行鼠疫菌鑒定的基礎(chǔ)。由于其操作簡(jiǎn)單,特異性比較理想,在缺乏動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)手段的情況下,鼠疫噬菌體裂解試驗(yàn)實(shí)際上已成為一線鼠疫防治機(jī)構(gòu)進(jìn)行鼠疫菌鑒定的“最終標(biāo)準(zhǔn)”。本文所報(bào)道的55023菌株在22℃、28℃、37℃不同的溫度下,均能被鼠疫噬菌體完全裂解,與鼠疫菌的表現(xiàn)完全一致;從其他表型上看,55023菌株也有一些鼠疫菌的特征。

表3 55023菌株的MLST結(jié)果Table 3 MLST results for strain 55023

然而一系列基于核酸的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,55023菌株缺失了大量的鼠疫菌基因(約12%),包括鼠疫菌的三個(gè)典型質(zhì)粒,及部分染色體基因(如pgm位點(diǎn)不完整),其所對(duì)應(yīng)的菌株基因組結(jié)構(gòu)與鼠疫菌存在較大差異[7]。55023菌株中缺失了14個(gè)DFR,該菌的DFR譜不同于任何鼠疫菌自然分離菌株[9],進(jìn)一步說明該菌株不具備鼠疫菌典型的基因組結(jié)構(gòu)。用兩個(gè)位于染色體上的鼠疫菌標(biāo)識(shí)基因引物[8]擴(kuò)增55023的DNA,結(jié)果均為陰性,表明該菌株基因組中無鼠疫菌標(biāo)識(shí)基因序列。針對(duì)55023菌株進(jìn)行的MLST分析結(jié)果表明,該株菌樣品中6個(gè)看家基因片段(2 509 bp)與已知的鼠疫菌存在16個(gè)堿基差異,而鼠疫菌中這些片段應(yīng)該是完全一致的[1],更進(jìn)一步表明55023不是鼠疫菌;55023的MLST序列與假結(jié)核菌血清Ⅲ型32937菌株只有兩個(gè)堿基的差異,提示該菌可能是血清 III型的假結(jié)核菌。對(duì)55023菌株進(jìn)行全基因組序列測(cè)定將會(huì)給出更為確切的結(jié)論。

以表型鑒定為基礎(chǔ)的原鼠疫診斷國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB15991-1995)在我國(guó)鼠疫防治工作中發(fā)揮了重要作用,但是在某些方面已經(jīng)不適應(yīng)當(dāng)前的需要;如果單純基于表型進(jìn)行鼠疫菌的鑒定,可能會(huì)導(dǎo)致誤報(bào)和漏報(bào)。2008年新頒布的鼠疫診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS 279-2008)已經(jīng)確定了核酸檢測(cè)在鼠疫菌鑒定中的重要作用;但由于新標(biāo)準(zhǔn)頒布時(shí)間不長(zhǎng),還需要有關(guān)部門加大宣貫工作的力度;同時(shí)提升基層鼠疫防治機(jī)構(gòu)的硬件水平,積極推廣分子生物學(xué)檢測(cè)手段,進(jìn)而提高鼠疫菌檢測(cè)鑒定的準(zhǔn)確性和可靠性。

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