羊種布氏菌體外藥物敏感性分析＊

姜 海,崔步云,趙鴻雁,樸東日,李蘭玉

布氏菌病(布病)是由布氏菌屬的細菌侵入機體后引起傳染-變態反應性人獸共患傳染病。布病是一個世界范圍內的重要的公共衛生事件,給流行地區和國家造成巨大的經濟損失并嚴重危害人類健康[1]。近年從全國十余個省市區分離的近百株布氏菌鑒定結果顯示,既往認為強毒的羊種菌仍然是當前的主要流行菌型,個別是牛種菌,野毒豬種菌多年未分離到;因而,羊種菌是引起疾病暴發的主要傳染源[2]。早期布病治療可以防止由急性轉為慢性,減少復發,消滅后遺癥。因此,早期合理用藥是治愈布病患者的關鍵。目前急性期布病的治療,多采用聯合抗菌療法,多西環素和鏈霉素或多西環素和利福平仍然是一線首選藥物。隨著醫藥學的不斷發展,一些新型抗生素被應用于布病的治療,如喹諾酮類、頭孢菌素類和大環內酯類等抗生素。近年來,國外已有布氏菌耐藥株的報道[3]。為了解我國羊種菌的耐藥譜并為臨床治療提供指導,本研究對全國不同地區2005-2009年分離到的69株羊種菌進行耐藥分析。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 69株分離自病人的地方株分別來自內蒙古自治區(10)、山西(9)、河北(10)、山東(4)、遼寧(18)、陜西(4)、長沙(1)、廣東(10)、云南(1)和浙江(2),由中國疾病預防控制中心傳染病所布病室保存。藥敏質控菌株為肺炎鏈球菌ATCC49169。

1.2 方法

1.2.1 細菌復蘇與鑒定從菌株庫取出標準和地方分離凍干菌株,復蘇、轉種于布氏菌專用培養基,生長48h后轉種1次,細菌鑒定應用布氏菌特異噬菌體、單項血清凝集和染料抑菌試驗。

1.2.2 藥敏實驗 藥敏板包括12種抗生素:阿奇霉素、克拉霉素、環丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、多西環素、利福平、頭孢曲松、復方新諾明、鏈霉素,由天津金章公司提供。藥敏試驗使用微量稀釋MIC法,判讀結果按美國實驗室標化委員會制定標準進行(CLSI2009,M100-S19)。

1.2.323S rRN A擴增與測序 1 013bp的部分23S rRN A基因(轉肽酶中心區)被擴增,引物序列為 (上游:5’-GGTGCTGGAAGGTTAAGA-3’,下游:5’-CGGTAAGCTGCA TGCGT-3’)。擴 增 參數:95℃5m;95℃30s,56℃30s,72℃50s;40個循環。PCR產物送至北京擎科生物公司純化測序。

2 結 果

2.1 藥敏結果 根據美國實驗室標化委員會制定標準,除了阿奇霉素和克拉霉素外,所有69株菌均對其它10種抗生素敏感。具體結果見表1。

2.2 23S rRN A序列所有菌株序列與B.abortus23S rrnA gene(GenBank:AE017223)比對 ,發現所有菌株都具有單核苷酸多態性2632 T/C。2632 T僅存在于大環內酯類敏感株B.suis中,部分菌株序列比對結果見圖1。

表1 羊種布魯氏菌體外藥物敏感試驗結果Table 1 Antimicrobial susceptibility ofB.melitensis

圖1 部分菌株23SrRNA轉肽酶中心序列比對結果Fig.1 Alighment of 23SrRNApeptidy transferase center nucleotides sequences of partialB.melitensisstrains

3 討 論

布氏菌為胞內寄生菌,在疾病的早期,細胞免疫及體液免疫聯合作用將入侵的布氏菌進行消滅而痊愈;若不能將其徹底殺滅清除,則布氏菌及其代謝產物和內毒素等反復刺激機體致敏 T淋巴細胞,當再次接觸布氏菌相關抗原時,致敏淋巴細胞就會釋放出各種淋巴因子,從而導致以單核細胞浸潤為特征的變態反應性炎癥,形成肉芽腫、纖維組織增生等慢性病變。所用的藥物只有進入細胞才能發揮作用,所以用于治療布病的抗菌藥物,既要在體外有殺菌作用,又要能滲入到細胞內,而且要達到足夠的濃度。多西環素、利福平和鏈霉素屬于這類藥物,因而一直作為患者的一線用藥。但由于這些抗生素對部分人毒副作用大,不能保證足夠的劑量和療程,因而很容易轉為慢性病人,從而導致布病治療的難度進一步加大,對國家布病防治規劃的有效實施構成嚴重威脅。2006年,希臘約阿尼納建議書指出:傳統的一線用藥仍是布病治療的金標準;復方新諾明和喹諾酮類可以作為二線替代藥物[6]。在一些發展中國家,布病和結核通常在某一社區共存,利福平耐藥株的出現已成為當地重大公共衛生問題之一。本研究結果發現遼寧省有12株菌達到較高利福平MIC值(2μg/mL),推測屬于中介值。利福平耐藥基因rpoB突變位點 PCR檢測可以驗證是否為真正耐藥,所有69株菌rpoB基因序列未發現任何突變(資料待發表)。但筆者認為應開展布病利福平耐藥監測工作。

大環內酯類抗生素結合于核糖體50S亞基的轉肽酶中心與肽輸出通道狹窄之間的部分,通過機械性的阻塞通道而抑制肽的延伸,從而阻礙蛋白質的合成而發揮抑菌作用。大環內酯類抗生素的結合位點位于核糖體50S亞單位的23S rRN A。Halling等人報道耐大環內酯類藥物突變位點在23S rRN AV區中心環的2632位,提示引起耐藥的主要機制是核糖體50S亞單位的23S rRN AV區中心環的點突變[7]。本研究發現所有菌株都對大環內酯類藥物呈現高水平耐藥,且突變位點也在23S rRN AV區中心環的2632T/C,而其他位點未發現突變,與文獻報道吻合。除此,Halling還指出藥物外排使菌體內藥物濃度降低而產生耐藥;中國菌株是否存在藥物外排機制還需進一步驗證。

盡管布氏菌的耐藥性不是布病防控領域內的關鍵問題,但合理選擇抗生素可以減輕布病疾病負擔,以利病人早日康復,為布病控制筑起第一道防線。

[1]Matyas Z,Fujikura T.Brucellosis as a world problem[J].Dev Biol Stand,1984,56(5):3-20.

[2]崔步云.中國布魯氏菌病疫情監測與控制[J].疾病監測,2007,22(10):649-651.

[3]Marianelli C,Ciuchini F,Tarantino M,et al.Genetic bases of the rifampin resistance phenotype inBrucellaspp[J].J Clin Microbiol,2004,42(12):5439.

[4]Brown SD,Traczewski MM.Broth microdilution susceptibility testing ofBrucellaspecies:quality control limits for ten antimicrobial agents against three standard quality control strains[J].J Clin Microbiol,2005,43(11):5804 5807.

[5]Turkmani A,Ioannidis A,Christidou A,et al.In vitrosusceptibilities ofBrucella melitensisisolates to eleven antibiotics[J].Ann Clin Microbiol Antimicrob,2006,5(1):24-27.

[6]Ariza J,Bosilkovski M,Cascio A,et al.Perspectives for the Treatment of Brucellosis in the 21st century:the ioannina recommendations the policy forum allows health policy makers around the world to discuss challenges and opportunities for improving health care in their societies[J].PLoS Medicine,2007,4(12):1872-1877.

[7]Halling SM,JensenAE.Intrinsic and selected resistance to antibiotics binding the ribosome:analyses ofBrucella23S rrn,L4,L22,EF-Tu1,EF-Tu2,efflux and phylogenetic implications[J].Microbiol,2006,6:84-99.