口蹄疫病毒非結構蛋白3Dpol的研究進展＊

孫靜靜，邵軍軍，?；菔|

口蹄疫（foot－and－mouth disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（Foot－and－mouth disease virus，F(xiàn)MDV）引起的偶蹄動物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。FMD是OIE規(guī)定的A類動物疫病之一，嚴重影響畜牧業(yè)的發(fā)展，對世界公共衛(wèi)生存在著巨大影響，造成巨大的經(jīng)濟損失，素有“政治經(jīng)濟病”之稱。FMD的致病原是小RNA病毒科，口蹄疫病毒屬成員，于1897年首次確定。FMDV是正鏈RNA分子，長約8 500bp，包裹于由60個拷貝的4種病毒結構蛋白VP1－4構成的二十面體的衣殼中。FMDV不僅宿主廣泛，傳播速度快，變異性強，而且血清型多，有7個血清型O、A、C、Asia 1、SAT 1、SAT 2、SAT 3和70多個亞型，且各血清型間無交叉免疫，同一血清型內(nèi)的不同亞型或分離株發(fā)生交叉免疫的程度均不相同，這種特性給口蹄疫的診斷和疫苗免疫帶來極大的困難。

FMDV的3Dpol蛋白是RNA依賴的RNA聚合酶（RdRp），沒有型特異性，在FMDV所有非結構蛋白中，3Dpol抗原性最好，ELISA檢測方法的特異性、準確性和敏感性與檢測結構蛋白的ELISA方法相當?shù)?，是區(qū)分是否接觸過FMDV動物的重要指標。FMDV的復制也是由病毒編碼的聚合酶3Dpol催化，但3Dpol蛋白酶的保真性很差，導致病毒復制的錯誤傾向率很高，每個核苷酸復制的錯誤配對率為10－3～10－5，這種低的復制保真性導致了后代快速突變，因此口蹄疫的防控比較困難。3Dpol是非結構蛋白，只是在病毒的復制過程中出現(xiàn)，病毒粒子成熟后僅僅有非常少量的3Dpol。本文綜述了口蹄疫病毒基因組結構及3D基因，3Dpol蛋白的表位、結構、功能的國內(nèi)外最新研究進展。

1 FMDV基因組結構

FMDV基因組為單股正鏈RNA，既是mRNA，又是負鏈RNA的模板，約有8 500個核苷酸（nts）組成，基因組的基本結構是：VPg－5′UTR（S－polyCIRES）－（L 蛋 白 ）－結 構 蛋 白 P1（VP4－VP2－VP3－VP1）－非 結 構 蛋 白 （2A－2B－2C－3A－3B－3B－3B－3C－3D）－3′UTR－poly（A）。

VPg在病毒RNA開始復制時起重要作用，同時參與病毒裝配，只有病毒RNA與VPg結合后，才能夠被裝入病毒。5′－UTR約含1 300個堿基。S片段由360個堿基組成，可形成一個長莖環(huán)結構（stem－loop）。S片斷下游是約400bp的 Poly（C）序列。Poly（C）片段幾乎全部由胞嘧啶組成，約占90%，僅有少量的U與A。IRES長約1 350bp，控制不依賴于帽子結構的FMDV RNA的翻譯起始。下游3′－UTR序列可自身折疊成莖環(huán)結構，對病毒基因組的復制有重要作用，復制過程中3′－UTR可以結合病毒復制相關蛋白。3′－UTR下游是長度不一的poly（A）結構，Poly（A）尾與病毒的感染性有關，Poly（A）越長感染性越強?；蚪M的中部是一大的開放閱讀框（ORF），編碼一多聚蛋白。基因組的ORF分為4個區(qū)域，分別為L區(qū)、P1區(qū)、P2區(qū)、P3區(qū)。多聚蛋白的裂解過程是由三種蛋白酶：Lpro，2A和3C來完成的，多聚蛋白經(jīng)3級裂解后，形成3～4種病毒結構蛋白（VP0或 VP4、VP2，VP3，VP1）和8～9種非結構蛋白（Lab、Lb、2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D）。ORF的5′末端為 L區(qū)，長約600bp，主要編碼N末端多聚蛋白Lab和Lb，兩種蛋白作為酶能在L／P1連接處進行自我切割釋放。L區(qū)的下游為P1區(qū)，P1區(qū)全長約2 200bp，編碼FMDV的4種結構蛋白VP4、VP2、VP3和VP1，分別由85、218、220個和213個氨基酸組成。P1區(qū)的下游為P2區(qū)，約1 460bp，編碼2A、2B和2C3種非結構蛋白，分別由16、154和318個氨基酸組成。P2區(qū)的下游為P3區(qū)，長約2 720bp，編碼約908個氨基酸的聚合蛋白，該聚合蛋白含有3A、3個3B、3C和3Dpol6種多肽。

2 3Dpol抗原表位的研究

FMDV的免疫保護與中和抗體水平和親和力有關，研究發(fā)現(xiàn)針對B細胞表位的合成肽免疫原性低，不能產(chǎn)生持久的保護水平的中和抗體。Collen等［2］的研究認為機體抗口蹄疫病毒是一種依賴T細胞的體液免疫應答反應，抗體的產(chǎn)生需要T細胞參與。迄今為止，除了在結構蛋白區(qū)發(fā)現(xiàn)部分T細胞表位外，越來越多的研究顯示，T細胞表位主要分布在FMDV非結構蛋白（3ABC和3Dpol）上。國內(nèi)外有關3Dpol蛋白T細胞表位的研究主要有：Collen［3］等在研究FMDV相關T細胞表位時發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MDV的非結構蛋白3Dpol具有刺激病毒感染牛外周血淋巴細胞增殖的能力，由此推測3Dpol上存在潛在的T淋巴細胞表位。Blanco等［4］發(fā)現(xiàn)，T細胞輔助表位區(qū)與B細胞表位區(qū)的串聯(lián)可以協(xié)助B細胞產(chǎn)生特異性抗體，提高優(yōu)勢抗原表位區(qū)的免疫原性。García－Briones等［5］用 表 達 FMDV 非 結 構 蛋 白3Dpol的痘苗病毒免疫豬，即使在豬體內(nèi)檢測不到中和抗體的情況下也能得到部分保護，這些豬在受到FMDV攻擊時出現(xiàn)典型臨床癥狀緩慢，結果與上述Collen等的推測基本一致。另外利用針對3Dpol氨基酸序列人工化學合成的重疊肽段對FMDV感染豬的外周血淋巴細胞進行刺激，結果發(fā)現(xiàn)很多肽段都能夠有效刺激淋巴細胞增殖，而且這些淋巴細胞能夠大量分泌IFN－γ等Th1類細胞因子。這一方面在一定程度上解釋了3Dpol蛋白能夠在無中和抗體條件下給動物提供部分保護的現(xiàn)象；另一方面也使人們進一步了解到3Dpol蛋白用于新型疫苗研究的潛在價值。WilhelmGerner等［6］在c／c和d／d單體型微型豬內(nèi)發(fā)現(xiàn)了口蹄疫3Dpol非結構蛋白上被SLA識別的特異的T細胞表位，位于346－370位氨基酸，這為口蹄疫新型疫苗的設計提供了有用的信息。不同種屬宿主和不同個體的T細胞對T細胞表位的識別是受到機體MHC分子多態(tài)性的限制的，3Dpol蛋白作為不同血清型及不同毒株之間相對保守的功能蛋白，極可能存在保守的病毒T細胞表位，能夠被不同的宿主及個體T細胞所識別。

圖1 口蹄疫病毒基因組結構和成熟蛋白［1］Fig．1 FMDV genome structure and matured protein［1］

3 3Dpol的表達時相及結構

3Dpol蛋白在病毒復制的早期產(chǎn)生。García－Briones等［7］研究了 FMDV 在 BHK－21細胞中的分布，免疫熒光試驗發(fā)現(xiàn)在感染后1．5h首先檢測到非結構蛋白3Dpol，之后2～2．5h才檢測到其他的非結構蛋白2B、2C、3B、3C，他們均以間歇分散的模式出現(xiàn)，3A和3Dpol集中在核的一側。經(jīng)共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)，雖然3Dpol短暫表達，但其在細胞核包括核仁中分布均勻，這與轉染3AB的細胞一致。在感染細胞中還發(fā)現(xiàn)3Dpol和其前體3CD，表明在FMDV感染時，這些蛋白可以同細胞核直接作用。

FMDV 3Dpol約有470個氨基酸殘基，形成典型的右手結構，與其它的聚合酶的三維結構一樣，有典型的手指、手掌和拇指亞結構。在 NH2末端（1－96位氨基酸）連接手指和拇指結構亞域的片段包圍著酶的活性位點，這個區(qū)域又稱為指套，與其他屬病毒的聚合酶相比，這是FMDV 3Dpol特有的。手指和手掌亞結構域包含6個不同的模體：A、B、C、D、E和F。手指亞結構域（97－207位和249－302位）包含8個α螺旋 （α3－α9）和7個β折疊 （β3－β7和β9－β10）；手掌亞結構域 （230－248位和303－403位）包含2個螺旋（α11，α12），5個β折疊片（β8，β11，β12，β14，β15），有3個β折疊片（β8，β11，β12）位于α11 和α12之間，這段區(qū)域是所有聚合酶中最保守的區(qū)域［8］，由5個保守模體A－E組成，在核苷酸結合、磷?；D移、手掌亞結構域的完整性和引導核苷酸結合方面發(fā)揮重要作用。拇指亞結構域（403－470位）包含4個α螺旋 （α13－α16）和2個卷曲［9］。

4 3Dpol的功能

FMDV 3Dpol首先以基因組正鏈為模板合成互補的負鏈RNA，然后再以負鏈為模板合成子代病毒的基因組的正鏈RNA。研究表明正鏈RNA病毒的復制有2種方式：引物依賴的RNA合成和引物非依賴的RNA合成即從頭合成。FMDV RNA合成是以VPg為引物的引物依賴的合成方式。之前研究已經(jīng)闡明了PV、FMDV和HRVs的RdRps的三維結晶結構，要么是非結合蛋白，要么是形成引物－模板－NTP底物復合物［11－12］。正鏈和負鏈 RNA合成的第一步是形成VPg－pU（帶有一個UMP的VPg同酪氨酸Tyr3共價結合），之后發(fā)生尿苷化，緊接著進行引物延伸。CV－B3RdRp采用了一個典型的RdRp折疊方式，與其它聚合酶一樣，RdRp亞結構域中最保守的是起催化作用的拇指結構域，2個天冬氨酸和2個二價的金屬離子都是催化作用必須的［13］。FMDV 3Dpol與 VPg結合位點和 CV－B3 RdRp與VPg結合位點不同，在FMDV 3Dpol與VPg殘 基 1－GPYAGPLERQPRPLKV－15 結 合，但 是CVB3 3Dpol－VPg 復 雜 結 構 表 明，VPg 7－PNQKPRVPT－15位殘基與3Dpol拇指結構域的底部結合。其實早在研究PV RdRp時，通過一系列的遺傳學和生物學實驗已經(jīng)證明了第2個結合位點的存在，并且通過結構驗證了其準確性［14－15］。3Dpol催化的FMDV RNA復制機制如下：

圖2 FMDV 3Dpol－RNA－RTP結晶結構［10］A：3Dpol與引物模板結合；B：3Dpol骨干；C：不同F(xiàn)MDV的3Dpol結構重疊Fig．2 FMDV 3Dpolcrystal structureA：3Dpol－template－pmimer molecular；B：3Dpol bone，C：superimposition of different FMDV 3Dpol

4．1 FMDV引物依賴性的復制起始 在RNA復制的起始，RdRp與病毒和宿主的許多蛋白相互作用。在小RNA病毒科中，3DPol使病毒編碼的引物蛋白VPg尿苷化，從而引發(fā)復制的起始［16］。3DPol和VPg 2個復合物的結構及其定點突變的效應分析，揭示了位于3DpolPol活性位點的殘基不僅參與與VPg結合，而且與RNA合成起始的VPg尿苷化反應密切相關［17］。

VPg采用幾乎不具二級結構的完全伸展的構相，結合在3DPol聚合酶的中心槽，VPg的N末端部分位于NTP通道附近，使突出的第3位Tyr殘基的側鏈深入活性位點區(qū)域，之后VPg滑行穿過大的RNA結合位點到達拇指結構域［18］。手指、手掌、拇指結構域的保守殘基對于VPg的結合穩(wěn)定性有重要作用。在3DPol－VPg－UMP復合物中，Tyr3側鏈的－OH與UMP分子的α－磷酸共價結合，模體F帶正電的殘基參與尿苷化反應，使Tyr3和UMP穩(wěn)定在一個合適的構象。模體A和C的天冬氨酸（Asp）及2個二價的陽離子也參與尿苷化反應，其機制與其它聚合酶催化的核苷酸酸轉移反應相似［19］。已有研究表明，在RNA復制起始和延伸過程中3Dpol聚合酶的結構不同。依據(jù)FMDV VPg的結構，復制起始時FMDV 3DPol模體B的保守殘基的307位天冬酰胺與尿苷化復合物的3′－OH作用，但 在 延 伸 過 程 中 是 2′－OH［20］。 氟 尿 苷 三 磷 酸（FUTP）是 VPg尿苷化的抑制劑，但不能抑制延伸。

PV蛋白酶和聚合酶前導蛋白3CD的結晶結構也完全支持FMDV的尿苷化模型，在3CD分子與VPg結合位點之間存在有大量接觸面，同樣FMDV 3Dpol－VPg復合物中3Dpol與VPg所形成的接觸界面，在病毒復制起始促進和調(diào)節(jié)VPg尿苷?；矫姘l(fā)揮重要作用［21］。

4．2 FMDV 3DPol引發(fā)的引物模板識別和鏈的延伸 有序的核苷酸轉移反應是RNA延伸的基礎。核苷酸轉移反應是引物鏈的3′－OH親核進攻核苷三磷酸的α－磷酸，從而形成磷酸二酯鍵，釋放PPi。根據(jù)兩個金屬離子催化模型，金屬離子A會降低引物3′－OH的pKa，從而引發(fā)去質子化；金屬離子B確定進入的核苷酸的方向，在PPi從聚合酶上釋放之前將其質子化［22］。但最近的另一項研究表明，不同的聚合酶催化的核苷酸延伸過程中的突變分析和動力學分析，PPi的質子供體是位于酶活性位點的帶正電的氨基酸殘基［23］。

正鏈RNA病毒的聚合酶的保守氨基酸殘基位于結合槽內(nèi)，是同核苷酸底物相互作用的優(yōu)勢候選物，如模體A和C上的兩個天冬氨酸（第245位Asp和第338位Asp），還包模體B上的保守殘基第303位 Thr，第304位Ser和第307位 Asn［24］。在自然底物ATP和UTP存在時，或有誘變劑如FUTP和利巴韋林三磷酸（RTP）存在時，得到4種FMDV 3DPol的催化反應復合物，由此發(fā)現(xiàn)RNA延伸過程可以分為4步［25］：第1步，3DPol－RNA－RTP復合物表明抗病毒誘變劑占據(jù)聚合酶的活性位點，與發(fā)生磷酰基轉移反應的位點相同；第2步，3DPol－RNA－ATP復合物表明形成新的堿基對，RNA產(chǎn)物易位，PPi釋放；第3步，3DPol－RNA－ATP／UTP 復合物表明RNA產(chǎn)物易位，新的底物定位到活性位點附近；第4步，3DPol－RNA－FUTP復合物表明突變核苷酸類似物FUTP與新生RNA結合，釋放PPi。4種復合物的比較表明，位于模板和引物核苷酸的結合位置的聚合酶殘基，參與識別和定位新的參與延伸反應的核苷酸。

5 結 語

有關FMDV 3Dpol結構和功能的研究有了一定的進展，但仍有許多未知。FMDV 3Dpol是非常保守的非結構蛋白，在病毒的復制和轉錄過程中發(fā)揮重要作用，也是非常有效的抗病毒靶標。現(xiàn)在也發(fā)現(xiàn)針對結構蛋白和結構蛋白2C、3A、3C的抑制劑，相信隨著科技的發(fā)展，一定會發(fā)現(xiàn)更多的抗FMDV復合物，從而為有效的控制此嚴重危害畜牧業(yè)發(fā)展的傳染性疾病做出貢獻。

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