2010年福建省手足口病患者中柯薩奇B5病毒的序列分析＊

翁育偉，周朝暉，陳 煒，鄭奎城，嚴延生

2010年福建省手足口病患者中柯薩奇B5病毒的序列分析＊

翁育偉1，2，周朝暉2，陳 煒2，鄭奎城2，嚴延生2

目的了解福建省手足口病患者中CVB5（Coxsackie virus B5）病毒的變異及進化特征。方法采集2010年福建省手足口病例呼吸道標本，經RD細胞分離腸道病毒。病毒分離上清用于RNA提取并經RT－PCR法鑒定病毒型別。對鑒定為其他腸道病毒（非EV71或CVA16）的病毒，擴增病毒完整VP1區，擴增產物經克隆、篩選后測序。應用Mega軟件對病毒VP1序列進行比較和種系進化分析。結果從2010年福建省手足口病患者中擴增得到6株完整的VP1區序列，序列比對證實有4株CVB5病毒，其他2株為Echo9病毒。序列差異比較表明，分離自福建省的CVB5病毒一致性程度較高，在種系進化上處于獨立的進化分支，而與國內其他省份或其他國家的CVB5病毒分離株比較則有較大差異。結論2010年福建省手足口病患者中存在CVB5病毒的感染，病毒與既往其它省份分離株有較大差異，提示CVB5病毒在福建省具有獨特的傳播鏈。

手足口??；柯薩奇B5；種系分析

手 足 口 病 （Hand－Foot－Mouth Disease，HFMD）是由多種人腸道病毒（Human enterovirus，HEV）引起的一種急性傳染病，以發熱和手、足、口腔等部位的皮疹或皰疹為主要癥狀，少數患者可出現無菌性腦膜炎、腦炎、急性弛緩性麻痹、神經源性肺水腫和心肌炎等中樞神經系統癥狀，個別重癥病例可導致死亡。腸道病毒型別復雜，所致臨床癥狀多樣。除腸道病毒71型（enterovirus 71，EV71）和柯薩奇病毒A16型（Coxsackie virus A 16，CVA16）為HFMD的主要病原體外，其他腸道病毒血清型，如柯薩奇 A 組病毒中的CVA2、4、5、6、9、10型，柯薩奇B組病毒的1－5型以及埃可病毒（Echovirus，E）中的E6、E9、E13、E25、E30等也可導致 HFMD或者無菌性腦炎、腦炎、麻痹等神經系統癥狀［1－3］。2010年，福建省在HFMD的病原學監測中發現了4例CVB5病毒感染病例，為了解這些病例中CVB5病毒的特征，我們對上述CVB5病毒的主要結構蛋白VP1進行了序列測定和分析。

1 材料與方法

1．1 材料 HFMD病毒呼吸道標本來自于HFMD監測哨點醫院。用于病毒分離的RD細胞為本單位保存。病毒RNA提取試劑、一步法RTPCR試劑盒以及PCR產物純化試劑均為Qiagen公司產品。TA克隆試劑盒、感受態細胞等購自Ta KaRa公司。引物（見表1）合成及序列測定由Ta KaRa公司完成。

1．2 方法

1．2．1 病毒分離 感染者呼吸道標本的采集和處理按中國疾病預防控制中心下發《手足口病監測方案（2010年版）》。人橫紋肌肉瘤（rhabdomyosarcoma，RD）細胞用含10%胎牛血清的細胞生長液（MEM）傳代，長滿單層后經胰酶消化，接種于斜面細胞培養管，置36℃、5%CO2培養，長至成80%～90%單層后，吸棄細胞生長液，更換成含2%胎牛血清的細胞維持液2 m L，接入處理好的標本200μL，繼續培養至第7 d，每天觀察細胞病變情況。如7 d內產生明顯細胞病變，則收集上清凍于－70℃，無細胞病變的取上清再盲傳一代。

表1 病毒鑒定引物及VP1區擴增使用的引物一覽表Tab．1 Primers used for viral identification and amplification of VP1 gene

1．2．2 病毒RNA提取和RT－PCR鑒定 收集病毒分離物，凍融3次后，10 000 r／min離心5 min。取上清140按Qiagen RNA mini kit說明書提取病毒RNA。病毒RNA洗脫于50洗脫液，－70℃保存備用。采用Qiagen One－step RT－PCR反應盒試劑盒做病毒型別鑒定。配置RT－PCR反應體系：5×buffer 5μL，d NTP（10mmol／L）1μL，上下游引物（10μmol／L）各1μL，酶混合物1μL，DEPC－treated H2O補足到20μL，加入5μL病毒RNA至總體積為25μL。按下列反應程序進行擴增：42℃反轉錄45 min；95℃滅活10 min；95℃，30 s；50 ℃，30 s；72℃，30 s；共35循環擴增，72℃，10 min后4℃保溫。分別使用引物 EV71－F／EV71－R，CVA16－F／CVA16－R和PE1／PE2做EV71、CVA16以及其他腸道病毒的鑒定。RT－PCR產物經1．5%瓊脂糖凝膠電泳后觀察。

1．2．3 病毒VP1區的擴增、片斷克隆及序列測定將上述鑒定為非EV71和非CVA16的其他腸道病毒培養物按上述方法提取RNA后，應用008／009引物擴增病毒的VP1區。除使用引物不同外，RTPCR反應體系同上。按下列反應程序進行擴增：50℃反轉錄30 min；95℃滅活15 min；95℃，40 s；50℃，40 s；72 ℃，1 min；共35循環擴增，72 ℃，10 min后4℃保溫。產物經1．5%瓊脂糖凝膠電泳后，按QIA Gel extraction試劑盒說明，回收純化目的條帶，置－20℃備用。純化后的擴增產物按試劑盒說明克隆至p MD－18T載體，轉化DH5α感染態細胞，篩選陽性克隆后交Ta KaRa公司測序。

1．2．4 CVB5病毒VP1區基因序列分析 應用DNAStar軟件對病毒序列進行拼接，經Blast程序在GenBank中作序列比對確定病毒血清型。從GenBank下載CVB5病毒完整VP1序列，應用Clustal w對下載的序列和本研究獲得VP1序列作多重排列，應用 Mega（version 3．1）軟件，比較不同病毒株VP1序列的差異，并做種系進化分析（Neighbor－Joining法）。

2 結 果

2．1 病毒分離與鑒定 應用RD細胞分離和RTPCR法，從2010年福建省手足口病監測哨點醫院送檢的標本中分離其他腸道病毒（非EV71或CVA16）共14株。

2．2 病毒VP1區的擴增 應用008／009引物對擴增其中6株病毒的VP1基因片段，回收產物經TA克隆到p MD18T載體后測序。VP1序列測定和blast比對表明，其中4株病毒為CVB5，另外2株為Echo9。4例CVB5病毒感染病例情況見表2。

表2 4例CVB5感染手足口病病例信息Tab．2 Information of 4 patients infected with CVB5 in Fujian Province

2．3 病毒VP1序列分析 不同地區和時間病毒分離株的VP1區序列比較表明，2010年福建省分離的4株CVB5病毒的核苷酸差異為1．17%（0．12%～2．16%），氨基酸的差異為0．55%（0～1．07%）。與浙江、山東以及韓國等地不同時間分離的CVB5病毒比較，福建省CVB5病毒與上述分離株的VP1區核酸的差異為4．93%～6．52%，而氨基酸的差異為0．64%～1．74%，見表3。與上述病毒VP1區氨基酸序列相比，福建分離株在VP1蛋白95位氨基酸為N，而其他參與比較的分離株在該位置則為S。2．4 種系進化分析 以VP1區序列做種系進化分析，全球不同地區和年度CVB5病毒至少可以分為2群（Linage，L），其bootstrap值分別為95和99。其中L1群病毒在亞洲和歐洲國家具有分布，而L2群病毒僅在歐洲國家（法國、白俄羅斯、英國等）流行。福建省CVB5病毒屬于L1群，但與國內山東、浙江以及韓國等地的病毒處于不同的分支上（Bootstrap值前者為99，后者為98），見圖1。

3 討 論

CVB5病毒屬于腸道病毒B組成員（Human enterovirus B species），在遺傳上與豬水泡病毒（Swine Vesicular disease virus，SVDV）相 似［10］。CVB5病毒感染可導致無菌性腦膜炎［4－5，11］等多種疾病，是常見的人感染腸道病毒血清型。1970－2005年美國腸道病毒監測表明，CVB5是人腸道病毒感染最常見的的血清型之一［3］。CVB5在法國、德國等歐洲國家的流行也較常見［7－8］。在亞洲，Baek等對2005－2006年韓國忠清南道無菌性腦膜炎病例的流行病學和病毒特征研究表明2005年病例有25%以上為CVB5感染［6］。國內在上世紀90年代就發現中樞系統感染者中存在CVB5腸道病毒感染的現象［12］。浙江省在2008年病毒性腦膜腦炎病例中，分離到5株CVB5病毒［11］。2009年山東HFMD流行期間，有近1／5腸道病毒為 CVB5［13］。福建省2010年HFMD監測中，從包括1例重癥病例在內的HFMD病例中分離到4株CVB5病毒。這些現象提示，在我國，CVB5可能成為除EV71、CVA16以外導致HFMD的又一重要腸道病毒血清型。

表3 CVB5病毒分離株VP1區序列差異分析Tab．3 Diversity of nucleotide and amino acid sequence in VP1 region of CVB5 isolates

圖1 CVB5腸道病毒分離株VP1區序列種系進化分析Fig．1 Phylogenetic analysis of VP1 region of CVB5 isolates

腸道病毒VP1編碼區在病毒分類和進化關系研究中具有重要意義［9］。我們對全球流行的CVB5病毒的VP1區的進化分析表明，不同國家和時期的CVB5病毒大致可以分為2個獨立的進化群（Linage，L），其中L1群包括了CVB5原型株、上世紀90年代和2005年左右歐洲流行的毒株以及流行于韓國、中國等亞洲國家的CVB5病毒，而2003－2006年期間在法國、白俄羅斯等歐洲國家流行的毒株構成了L2群。值得注意的是，2010年福建省分離的CVB5病毒屬于L1群，但與該群的其他毒株比較，4株病毒構成了一個相對獨立的進化分支。VP1區核酸序列差異分析表明，山東、浙江以及韓國分離的毒株序列差異為0．18%～3．34%，而福建省CVB5分離株與上述毒株的差異為4．93%～6．52%，因此推斷福建省CVB5的流行可能存在著不同于國內其他省份的傳染源，但從病毒氨基酸序列比較表明，福建省CVB5病毒與其他省份和韓國等地的病毒差異不大，為0．64%～1．74%，較為明顯的差異存在于VP1氨基酸序列的95位，福建省分離株在95位上為N，而其他省份以及韓國分離株則為S。上述結果提示，福建省CVB5病毒和其他省份以及韓國的CVB5分離株的抗原特征相似。

了解HFMD病例的病原譜和流行病學特征是HFMD防控工作的重要環節。目前，HFMD的病原體主要為腸道病毒EV71和CVA16，對其遺傳進化特征的研究較多，而對HFMD病例中的其他腸道病毒的遺傳進化特征則較少研究。由于其他腸道病毒在HFMD的病原譜中也占有相當的比例，因此做好HFMD防治工作，必須了解這些病毒的遺傳進化、抗原變異等特征?；诖耍狙芯繉Ω＝ㄊ》蛛x的CVB5病毒的主要抗原基因進行了遺傳進化特征分析，為今后福建省HFMD的防治提供了基礎資料。

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Phylogenetic analysis on Coxsackie virus B5 isolated from Fujian Province，2010

WENG Yu－wei，ZHOU Chao－hui，CHEN Wei，ZHENG Kui－cheng，YAN Yan－sheng

（Fujian Center for Disease Control and Prevention，Fuzhou 350001，China）

The aim was to explore the variance and phylogenetic features of Coxsackie virus B5（CVB5）isolated from hand－foot－mouth disease（HFMD）patients in 2010 in Fujian，China．The respiratory specimen from HFMD patients were collected and cultured on RD cells for viral recovery．Viral RNA was extracted form the supernatant of culture and used for viral typing by reverse－transcript PCR．The whole VP1 region of the CVB5 isolates was obtained by RT－PCR，and followed by cloning into plasmid and sequencing．The variance and phylogenetic relation between CVB5 isolates from Fujian and that from other provinces and counties were calculated by using Mega software．It was found that of 6 viral isolates from Fujian Province in 2010，four were identified as CVB5 and the others were Echo9．The sequence analysis indicated that the CVB5 isolates from Fujian shared higher identity and formed a distinct branch on the phylogenetic tree，whereas showed more difference when compared with isolates from other province in China and from other countries．These results demonstrated that CVB5 virus had emerged in HFMD patients in Fujian and the transmission chain of CVB5 virus in Fujian might be distinct from that from other provinces．

hand－foot－mouth disease；Coxsackie virus B5；phylogenetic analysis

R373．2＋3

A

1002－2694（2011）12－1086－04

＊福建省自然科學基金項目（No．2010J01115）資助

嚴延生，Email：yysh＠pub1．fz．fj．cn

1．福建醫科大學，福州 350001；2．福建省疾病預防控制中心，福州 350001

2011－05－10；

2011－08－29