多重熒光定量PCR甄別3種霍亂弧菌相關毒素基因＊

金大智，張 政，羅 蕓，葉菊蓮，程蘇云，吳 方，金 郁

多重熒光定量PCR甄別3種霍亂弧菌相關毒素基因＊

金大智1，張 政1，羅 蕓1，葉菊蓮1，程蘇云1，吳 方2，金 郁3

目的 為了判定霍亂弧菌是否攜帶相關毒力因子，研發一種快速、準確、特異檢測霍亂弧菌3種毒素基因的多重熒光定量PCR方法。方法針對霍亂弧菌ctx A、ace、zot基因設計引物和探針，建立PCR體系，對70株霍亂弧菌分離株進行鑒定，采用直接測序方法對鑒定結果進行驗證。結果建立的多重實時熒光定量PCR方法可同時準確、特異地鑒定霍亂弧菌菌體攜帶的3種毒素基因，不攜帶毒素基因的菌株均未出現陽性檢測結果。菌體檢測的最低檢出限度ctx A基因：102CFU／m L，ace基因和zot基因：10 CFU／m L。構建了3種毒素相關基因陽性質粒，ace基因和zot基因的最低檢出限度為10 copies／μL，ctx A基因的最低檢出限度為102copies／μL，定量檢測批間和批內的變異系數均小于5%；對70株霍亂弧菌分離株進行評價，結果顯示其中40株（57．2%）攜帶ctx A毒素基因、31株（44．3%）攜帶ace毒素基因、46株（65．7%）攜帶zot毒素基因，通過測序方法驗證，符合率達到100%。結論本文建立的多重實時熒光定量PCR方法操作簡便、特異性好、靈敏度高，為霍亂弧菌的現場流行病學調查和疫情監測提供了快速、可靠的鑒定工具。

多重實時熒光定量PCR；霍亂弧菌；毒素

霍亂是由霍亂弧菌引起的急性腸道傳染病，是《中華人民共和國傳染病防治法》規定的甲類傳染病之一，具有發病急、傳播快、波及范圍廣等特點，曾在世界上引起多次大規模流行。主要表現為嘔吐、失水、腹瀉等癥狀［1－2］。目前認為只有 O1和 O139血清群霍亂弧菌引起霍亂疫情，主要的致病因素取決于菌體本身攜帶的生物學特征，霍亂弧菌的毒力因子包括霍亂毒素（Cholera toxin，CT）、小帶聯結毒素（Zonula occludens toxin，ZOT）、輔助霍亂腸毒素（Accessory cholera enterotoxin，ACE）等［3－4］。在疫情防制過程中，分離的霍亂弧菌是否攜帶毒素是判定疫情極為重要的參考指標，不攜帶毒力因子的霍亂弧菌通常致病力不強，僅引起腹瀉等輕微臨床癥狀，不會導致大規模流行。因此，對霍亂弧菌菌體攜帶的毒力因子進行檢測、對產毒株與否的鑒定是及時、有效地判斷疫情暴發機率和評價疫情嚴重性的前提和基礎，為進一步采取防制措施提供可靠的依據。

目前，霍亂弧菌常規檢測以傳統培養方法為主，不僅操作繁瑣，耗時長，無法判定菌體內是否含有毒力因子。針對霍亂弧菌毒素分子鑒定主要依靠動物實驗模型和細胞方法、免疫學實驗方法［5－7］，實驗周期長，動物個體差異較大，可比性不強，操作步驟繁多，而且每次實驗只能對一種目標毒素進行檢測，無法同時鑒定多種毒素因子，無法達到疫情控制的需要。分子生物學技術能夠在很大程度上提高檢測效率，目前已經廣泛應用于病原菌的檢測和毒素基因鑒定領域［8－9］。但是由于菌體攜帶毒力因子的狀況比較復雜，依靠多重熒光定量PCR技術能夠通過一次實驗操作得到較為完整的菌體攜帶毒素因子信息。本實驗選取霍亂弧菌ctx A（霍亂毒素A亞單位基因）、ace（輔助霍亂腸毒素基因）、zot（小帶聯結毒素基因）作為檢測靶基因，設計引物和標記不同熒光波長基團的Taq Man探針，建立多重實時熒光定量PCR檢測霍亂弧菌3種毒素相關基因的方法。

1 材料與方法

1．1 實驗菌株 本實驗使用的菌株如下：O1群霍亂弧菌小川型、O1群霍亂弧菌稻葉型、O139群霍亂弧菌標準株M045和地方株、非O1、非O139群霍亂弧菌（分離株）及其他傳染病相關病原菌如腸產毒性大腸桿菌、腸致病性大腸桿菌、腸侵襲性大腸桿菌、腸出血性大腸桿菌O157∶H7、腸炎沙門菌、傷寒沙門菌、甲型副傷寒沙門菌、乙型副傷寒沙門菌、丙型副傷寒沙門菌、福氏志賀菌、宋內志賀菌、副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌、空腸彎曲菌、枸櫞酸桿菌、金黃色葡萄球菌、河弧菌、產氣莢膜梭菌、腸球菌等65株標準菌株或分離株，均由浙江省疾病預防控制中心菌種室提供。

1．2 儀器和試劑 本實驗采用MX3000P實時定量PCR儀（Stratagene公司）；icycler PCR儀（Bio－Rad公司）；比濁儀（法國酶里埃公司）；Taq酶、d NTPs等實時熒光定量PCR相關試劑購自上海輝睿生物科技有限公司、大腸桿菌感受態細胞JM109、DNA凝膠回收試劑盒（DV805A）購自寶生物工程（大連）有限公司，p GEM－T試劑（A3600）和質粒提取試劑盒（A7100）購自Promage公司。常規培養試劑等購自法國酶里埃公司。

1．3 模板制備 標準菌株基因組DNA提取：將200μL含有純細菌的培養液以10 000 r／min離心5 min，棄上清，加入25μL純水重懸后，煮沸10 min，10 000 r／min離心2min，取上清液作為模板－20℃備用。為了進行靈敏度評價，采用平板稀釋法制備系列10倍梯度稀釋的標準品。分離株模板制備：采集的樣本按照常規方法（衛生行業標準：WS289－2008）進行前增菌，6～8 h后，煮沸裂解10 min，12 000 r／min離心2 min，取上清液作為模板，待用。

1．4 引物和探針設計與合成 針對霍亂弧菌的霍亂毒素A亞單位基因（ctx A）（EF158842）、輔助霍亂腸毒素基因（ace）（AF416590）、小帶聯結毒素基因（zot）（AF516349），采用 Primer Express 3．0 軟件設計引物和探針，PCR產物長度分別為171 bp、150 bp和79 bp。ctx A 基因上游引物F1：5′－AAC GTT AAT GAT GTA TTA GGG GCA T－3′；下游引物R1：5′－GTT ACT GTA ATA TCT ATC TCT GTA G －3′；探 針 P1：5′（HEX）－ATA CTC CCA AAT ATA TGG ATG GT－（BHQ1）－3′；ace基因上游引物 F2：5′－GGA GAT GTC CCA GAA AGT GAT TG －3′；下 游 引 物 R2：5′－CGG GTC ATC AAA GCC TGA AG－3′；探針 P2：5′－（FAM）－TGC TGC CTC CTC AAT ACA GCG GCT－（BHQ1）－3′；zot基因上游引物 F3：5′－CAC CAC GGC TGG GAT ATC TG－3′；下游引物R3：5′－CTA TCT CCG CCG CCT CTC T－3′；探針 P3：5′－（610）－CAC GCC TAA CAT TGC CAA AGT GCA－（BHQ2）－3′，引物和探針均由上海輝睿生物科技有限公司合成并純化。

1．5 標準質粒構建 參照《分子克隆實驗指南》實驗方法［10］，分別將ctx A、ace和zot基因的PCR片段切膠回收后連接至p GEM－T載體，PCR反應體系和條件如下：PCR反應體系為50μL，包括1（PCR buffer，0．2 mmol／L d NTPs，1．5 mmol／LMgCl2，上游引物：0．5μmol／L，下游引物：0．5

μmol／L，模板DNA 2μL（40～100 ng），Taq酶0．25 U，用dd H2O補足至50μL。PCR反應條件為95℃ 預變性5 min；95℃20 s，55℃20 s，72℃20 s，共40個循環，72℃5min，4℃ ∞。然后將連接PCR片段的載體轉化到大腸桿菌感受態細胞JM109中。通過對重組質粒的篩選確定連接3種不同基因PCR片段的陽性轉化細菌，菌種采用甘油－80℃保存，質粒提取參照試劑盒說明書。

1．6 多重實時熒光定量PCR擴增 采用矩陣法優化PCR反應體系中的引物、探針濃度和MgCl2濃度等因素，得到合適的濃度比例。熒光定量PCR擴增體系和反應條件：PCR反應體系為25μL，包括1×PCR buffer，0．2 mmol／L d NTPs，5．0 mmol／L MgCl2，F1：0．60μmol／L，R1：0．40μmol／L，F2：0．32μmol／L，R2：0．48μmol／L，F3：0．48μmol／L，R3：0．32μmol／L，P1：0．36μmol／L，P2：0．2μmol／L，P3：0．2μmol／L，模板 DNA 4．0μL（50～200 ng），Taq酶0．25 U，用dd H2O 補足至25μL。PCR反應條件為95℃ 預變性5 min；95℃15 s，60℃45 s，共40個循環，熒光采集在每個循環的退火溫度時進行。

1．7 靈敏度和重復性評價 參照《分子克隆實驗指南》計算提取的質粒DNA濃度［10］，然后10倍梯度稀釋成一系列的質粒標準品；將霍亂弧菌標準株采用比濁法參照比濁儀說明書計算公式進行平板計數得到初始濃度（CFU／m L），再制成系列10倍梯度稀釋的標準品。選取質粒標準品中高濃度和低濃度的模板，每個模板做3次重復試驗，計算不同濃度模板各重復反應CT值之間的變異系數。

1．8 樣本分離株檢測 本實驗共收集70份霍亂弧菌分離株，分別進行實時熒光定量PCR檢測和測序鑒定，比較2種方法的結果，進一步評價本文建立方法的可靠性，實驗方法同上。

2 結 果

2．1 特異性實驗結果 霍亂弧菌攜帶的霍亂毒素A亞單位基因（ctx A）、輔助霍亂腸毒素基因（ace）、小帶聯結毒素基因（zot）是判斷霍亂弧菌是否為產毒株的重要指標。從BLAST結果可以看出3種毒素相關基因的特異性較高，與其他致病菌攜帶的毒素基因無同源性。試驗中共選取65株標準菌株和分離株對該方法進行特異性評價，結果顯示含有3種毒素基因的霍亂弧菌均有特異性熒光信號產生，其中部分菌株只含有1種或者2種靶毒素基因；而其他不攜帶3種毒素基因的菌株均無陽性熒光信號產生（圖1）。上述檢測陽性結果通過測序進行驗證，測序結果與多重實時熒光定量PCR結果完全一致。實驗結果說明本實驗篩選的3對引物和探針特異性高，完全符合檢測的需要，能夠特異性地擴增3種毒素基因，有效地鑒定菌體攜帶3種毒素基因情況。

圖1 特異性擴增結果Fig．1 Specificity of Vibrio Cholerae

2．2 多重實時熒光PCR檢測的靈敏度 按照上述的比濁法進行平板計數的初始濃度，制成系列10倍梯度稀釋的標準品，稀釋的線性范圍為101～106cfu／m L，基因組DNA提取后進行多重實時熒光PCR檢測，按照出現明顯擴增曲線判定為陽性結果。霍亂弧菌3種毒素（ctx A、ace、zot）基因檢測的靈敏度評價結果見圖2，結果顯示除了ctx A基因檢測10 CFU／m L未出現陽性信號外，純培養霍亂弧菌檢測另外2個基因對應的6個梯度其余均出現陽性擴增信號，因此說明本方法檢測ctx A的最低限度為102CFU／m L，ace和zot基因的最低檢測限度為10 CFU／m L。同時，為了定量分析待檢模板的初始濃度，根據每個反應管測定的Ct值與管中所含模板濃度之間的對應關系，繪制成標準曲線，R2分別為0．990、0．993、0．994（圖3），從結果可以看出標準曲線的線性關系良好，可以準確的計算出模板濃度。本實驗還對質粒DNA標準品的靈敏度進行評價，將10倍梯度稀釋的質粒DNA（101～106copies／μL）進行多重實時熒光定量PCR擴增。結果顯示濃度為10 copies／μL的ace基因和zot基因陽性質粒均能得到陽性擴增信號，而10 copies／μL的ctx A基因陽性質粒無擴增信號產生。因此，ace基因和zot基因的最低檢出限度為10 copies／μL，ctx A基因的最低檢出限度為102copies／μL，3個目的基因PCR擴增的R2分別為0．989、0．999和0．999，檢測結果見圖4，標準曲線結果見圖5。從上述實驗結果可以看出不管是采用陽性質粒還是采用霍亂弧菌標準株評價靈敏度均獲得了較好的線性關系，可以準確地判斷PCR反應體系中初始模板的數量。

2．3 多重實時熒光定量PCR的重復性 對上述靈敏度評價實驗中的10倍系列稀釋的霍亂弧菌ctx A陽性質粒、ace陽性質粒和zot陽性質粒分別選取3個不同濃度的模板（106copies／μL、103copies／μL、10 copies／μL），每個濃度做3次重復試驗，通過計算Ct值的差異（變異系數，CV）評價多重實時熒光定量PCR方法的重復性和穩定性。計算出不同濃度模板各重復反應Ct值之間的變異系數分別為ctx A基因：0．274%、0．191%、0．235%；ace基因：0．738%、0．692%、0．671%；zot基 因：0．891%、0．938%、0．959%。上述實驗結果顯示針對3種毒素基因檢測反應的CV值均小于5%，說明該實驗所建立的方法具有較高的重復性，穩定性好，實驗結果可靠。

2．4 霍亂弧菌毒素基因的檢測結果 本實驗共收集70株霍亂弧菌實際樣本分離株，其中包括15株O139群霍亂弧菌、43株O1群霍亂弧菌和12株非O1群／非O139群霍亂弧菌，分別來自外環境和臨床病人。采用多重實時熒光定量PCR對收集的70株霍亂弧菌分離株攜帶3種毒素基因（ctx A、ace、zot）進行鑒定，同時用直接測序的方法驗證多重實時熒光PCR檢測結果的正確性。結果顯示70株霍亂弧菌中，40株（57．2%）攜帶ctx A毒素基因、31株（44．3%）攜帶ace毒素基因、46株（65．7%）攜帶zot毒素基因。31株（44．3%）含有全部的3種毒素基因，其中包括6株O139群霍亂弧菌和25株O1群霍亂弧菌；9株（12．9%）同時攜帶ctx A毒素基因和zot基因，其中8株O139群霍亂弧菌和1株O1群霍亂弧菌；6株（8．6%）只攜帶zot基因，其中包括1株O139群霍亂弧菌和5株O1群霍亂弧菌；24株（34．3%）均不攜帶上述3種毒素基因，其中包括12株非O1群／非O139群霍亂弧菌和12株O1群霍亂弧菌。上述結果通過測序方法驗證，符合率達到100%，結果見表1，部分菌株熒光定量PCR擴增結果見圖6。

圖6 多重熒光定量PCR檢測部分樣本分離株的結果Fig．6 Results of part of Vibrio Cholerae detected by using multiplex real time PCR

表1 70株霍亂弧菌分離株攜帶3種毒素基因的檢測結果Tab．1 Results of detecting three toxin genes of 70 Vibrio Cholerae isolated from samples

3 討 論

霍亂弧菌是引起感染者嚴重腹瀉的病原菌，是國家衛生部重點監測的病原體之一，據報道霍亂弧菌已被劃分為200多個血清群，但是只有O1群和O139群霍亂弧菌引起疾病大流行［11－12］。菌體是否攜帶霍亂毒素是判定霍亂弧菌為流行株還是非流行株的重要分子標記，非流行株不能導致疾病大規模流行，只會引起散發性病例。目前，實際工作中霍亂弧菌的診斷和血清學鑒定仍然停留在常規的培養和特異性抗體凝集實驗，實驗周期長，步驟繁瑣，而且只采用普通PCR鑒定霍亂弧菌是否攜帶霍亂毒素，并沒有對其他霍亂弧菌毒素進行檢測，使得檢測的結果信息不完整，不詳細。霍亂弧菌攜帶的霍亂毒素是最早被確定導致人體腹瀉的因子，但是最近的研究發現不攜帶霍亂毒素的菌體也可以致病，其原因主要是由于菌體產生ZOT、ACE等其他致病相關毒素［13］。因此對霍亂弧菌菌體內攜帶的多種毒素基因進行鑒定對于流行病學監測來說具有重要意義。

近些年，隨著分子生物學技術的快速發展，多項技術（脂質體法、比色生物學檢測法和膠體物理和膜生化法等）已經應用到了霍亂弧菌攜帶相關毒素的鑒定領域［14－17］。在基因診斷方面，主要使用的分子生物學技術有普通PCR、多重PCR、實時熒光定量PCR、Pit－stop半巢式PCR、生物傳感器、LAMP技術等，擴增的靶基因分別為ctx A、ctx A2－B、rtx A、eps M、msh A、tcp A、omp W、O1和 O139 rfb、zot和tcp B等［7，18］。隨著熒光定量PCR儀器檢測通道和標記不同波長的熒光分子種類的不斷增多，同時在同一個反應體系中檢測的靶基因種類也越來越多，而且目前熒光基團標記的成本較低，使得多重實時熒光定量PCR技術被廣泛應用到分子診斷領域。

本實驗選取霍亂弧菌ctx A基因、ace基因、zot基因作為檢測靶點，設計引物和Taq Man探針，通過BLAST比對和多種標準菌株驗證，從圖1的結果中可以看出，本實驗能夠特異性地檢測霍亂弧菌的ctx A基因、ace基因、zot基因，其他不攜帶3種靶基因的菌株均無陽性信號出現，說明本文所建立的方法特異性好，結果準確、可靠。本實驗采用矩陣法針對熒光定量PCR反應體系中的引物濃度、探針濃度、MgCl2濃度、退火溫度和退火時間等因素進行系統地優化，最終獲得合適的反應體系和反應條件。采用標準菌株和重組陽性質粒標準品分別對多重實時熒光定量PCR檢測靈敏度進行評價，圖2和圖3的結果顯示針對純培養霍亂弧菌的檢測，ctx A基因檢測的靈敏度達到102CFU／m L，ace和zot基因檢測的靈敏度達到10 CFU／m L。同時評價重組陽性質粒標準品的靈敏度結果可以看出ctx A基因檢測的靈敏度達到102copies／μL，ace和zot基因檢測的靈敏度達到10 copies／μL。上述結果表明多重熒光定量PCR體系中，不同的引物和探針之間存在一定的干擾，探針標記的不同熒光基團之間也存在相互的影響，無論是對純培養細菌還是對重組陽性質粒進行評價，ctx A基因均低于ace和zot基因檢測的最低限度。將3對引物和探針分別進行單管擴增時，結果顯示檢測的靈敏度均可達到10 CFU／m L，說明影響多重PCR反應的因素很多，3對引物和探針存在同一體系中時擴增效率不一致，熒光基團之間相互抑制。在進一步的工作中如在反應體系中再增加引物和探針的數量，需要更系統地對體系中多個因素進行優化，同時需要考慮熒光基團發射熒光的波長，盡量選擇波長相差較大的基團，這樣會避免熒光的相互干擾。

本實驗對70株霍亂弧菌實際樣本分離株進行檢測，從表1中的結果可以看出40株（57．2%）攜帶ctx A基因，其中大部分是來源于人源性標本，而且臨床腹瀉、嘔吐等癥狀比較明顯，部分外環境分離的菌株也攜帶ctx A毒素基因。31株霍亂弧菌攜帶全部的3種靶毒素基因，9株霍亂弧菌同時攜帶ctx A毒素基因和zot基因，結果說明菌體攜帶3種毒素基因的機率較高，無論是從人體標本還是外環境中分離的霍亂弧菌均具有較強的致病性和傳播流行能力。結果中還顯示6株不攜帶ctx A毒素基因的菌株攜帶zot基因，而且樣本全部來源于人源，說明在霍亂弧菌攜帶毒素鑒定的工作中，僅僅檢測霍亂毒素是不能滿足判定流行趨勢的要求［19］。表1中還顯示了24株分離株不攜帶3種毒素基因，其中包括12株非O1群／非O139群霍亂弧菌，這也驗證了非O1群／非O139群霍亂弧菌不具備較強的致病能力，但是這并不能說明這類霍亂弧菌對人體無致病力，這些菌株可能攜帶其他毒素基因。上述結果與直接測序的結果進行比較，符合率達到100%，進一步說明了本實驗所建立的鑒定方法準確、可靠、穩定性好。目前，本實驗室采用熒光定量PCR等分子生物學技術手段對非O1群／非O139群霍亂弧菌攜帶毒素基因情況進行調查，尋找這類霍亂弧菌主要導致人體致病的毒素因子。

本實驗選取取霍亂弧菌ctx A（霍亂毒素A亞單位基因）、ace（輔助霍亂腸毒素基因）、zot（小帶聯結毒素基因）作為檢測靶基因，建立多重實時熒光定量PCR檢測霍亂弧菌3種毒素基因的方法。ctx A基因的最低檢出限度為102CFU／m L和102copies／μL，ace基因和zot基因最低檢出限度為10 CFU／m L和10 copies／μL，重復性好；對70株霍亂弧菌分離株進行評價，結果顯示本方法快速、準確，結果可靠，為流行病學預警和流行趨勢判定提供了可靠分析工具，為研究霍亂弧菌菌體攜帶毒素基因狀況分析提供了簡便的實驗工具。

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Discrimination on three related toxin genes of Vibrio Cholerae using by multiplex real time PCR

JIN Da－zhi，ZHANG Zheng，LUO Yun，YE Ju－lian，CHENG Su－yun，WU Fang，JIN Yu

（Zhejiang Provincial Center for Disease Control and Prevention，Hangzhou 310051，China）

In order to assess Vibrio Cholerae which containing related toxin genes，a rapid，sensitive and specific assay based on multiplex real time PCR was developed in this study．The cholera toxin sub－unit A gene（ctx A），accessory cholera enterotoxin gene（ace），and zonula occludens toxin gene（zot）of Vibrio Cholerae was chosen as targets，and then the primers and Taq Man probe were designed．Furthermore，multiplex real time PCR was applied to detect 70 Vibrio Cholerae isolated from samples，and PCR products were sequenced in order to affirm the results of multiplex real time PCR．The results showed that ctx A，ace and zot gene of Vibrio Cholerae were detected by using multiplex real time PCR accurately and quickly．When other bacteria containing no all three target toxin genes were detected，no positive results appeared．The sensitivity was 102cfu／m L for ctx A gene and 10cfu／mL for ace and zot gene in pure culture．The standard plasmids according to each toxin gene were constructed，and consequently the detection limit of ace gene and zot gene was 10copies／μL and the detection limit of ctx A gene was 102copies／μL．The coefficient of variation of intra－assay and inter－assay was less than 5．0%．When this assay was applied directly to identify 70 Vibrio Cholerae，the results showed that 40 strains（57．2%）were positive to ctx A gene，31 strains（44．3%）were positive to ace gene，and 46 strains（65．7%）were positive to zot gene．The results above were the same to the results obtained from the sequencing assays．The coincidence was 100%．It is demonstrated that multiplex real time PCR is a simple，accurate and feasible assay for discriminating three related toxin genes of Vibrio Cholerae．The assay described here provided a reliable tool for epidemiologic survey and epidemic monitoring．

multiplex real time PCR；Vibrio Cholerae；toxin

1．浙江省疾病預防控制中心，杭州 310051；2．海寧市疾病預防控制中心，海寧 314400；3．遼寧師范大學實驗中心，大連 116029

R378．3

A

1002－2694（2011）12－1065－06

＊“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治科技重大專項”“傳染病檢測技術研究－傳染病病原體診斷和組合檢測技術”課題（2008ZX10004－002）和“霍亂弧菌核酸快速甄別方法研究及分子分型數據庫的建立”課題 （2010KYB110）聯合資助

金大智，Email：dzjin＠cdc．zj．cn

2011－06－17；

2011－10－21