口蹄疫病毒基因組結構及功能最新研究進展＊

張克山,劉永杰,盧國棟,劉湘濤

口蹄疫是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性人獸共患傳染病?？谔阋叩谋┌l和流行帶來嚴重的經濟損失和不良的政治影響,同時對人們身體健康帶來嚴重威脅,被世界動物衛生組織列為必須上報的動物傳染病之首。FMDV基因組RNA全長約為 8.5kb,由 5′非翻譯區(5′U TR),開放閱讀框架(ORF)和 3′非翻譯區 (3′U TR)組成 ,尾部帶有PolyA(圖 1)。5′U TR 全長約 1 300bp,最前端是VPg,緊接著是S片段、Poly(C)區段,功能未知區和內部核糖體結合位點[1]。ORF長約7.0kb編碼聚合蛋白由L基因、P1結構蛋白基因、P2和P3非結構蛋白基因以及起始密碼子和終止密碼子組成,此聚合蛋白隨后逐漸被降解為病毒所需的各種組分:Lab/Lb、1A(VP4)、1B(VP2)、1C(VP3)、1D(VP1)、2A。3′U TR 長約 172bp,為高度的莖環結構,與病毒基因組復制相關,由poly(A)以及poly(A)和P3區之間的堿基組成。了解FMDV基因組結構及功能有助于該病的快速診斷和新型疫苗的開發,本文詳細闡述了FMDV的基因組結構中每個基因的最新研究進展。

1 FMDV 5′UTR

FMDV 5′U TR包括:Vpg、S 片段、Poly(C)區段、內部核糖體進入位點(Internal Ribosome Entry Site,IRES)、擬節、cre 等結構[1]。

圖1 FMDV基因組結構示意圖(引自參考文獻[3])Fig.1 Schematic diagram of FMDVgenome structure(cited from reference[3])

1.1 Vpg 、S 片段、Poly(C)區段、PKs和 cre區段Vpg實質上是由FMDV 3B基因編碼的蛋白,這種蛋白的酪氨酸殘基與RNA 5′末端尿嘧啶通過磷酸二脂鍵共價相連,VPg蛋白不是FMDV病毒感染性所必需基因,但它在病毒粒子包裝和起始病毒RNA合成以及在RNA指數合成到線性合成過程中扮演開關調控作用。S片段長約360 bp,高度保守且5′和3′端相互配對,形成三葉草狀莖環結構。推測S片段可能是聚合酶的一個結合位點,對FMDV的復制、致病性和宿主范圍有一定的影響[3]。研究者在研究關于FMDV感染性克隆時發現:只有當C的數目超過一定閾值后病毒才能夠獲得拯救[4]。緊接 Poly(C)區段的是3～4個 RNA假結(Pseudoknots,PKs)[5],不同毒株假結的長度不同,但是這些RNA PKs在 FMDV病毒中扮演什么角色還不得而知。Cre呈“發夾”結構緊接在 FMDV RNA PKs后,這一結構首先發現于人的鼻病毒,是小核糖核酸病毒復制所必須的基因[6]。

1.2 IRES、Lpro內部核糖體進入位點(Internal Ribosome Entry Site IRES)同時存在于小RNA病毒科其它屬RNA病毒和一些細胞內mRNA中[7]。IRES為高度保守的莖環結構,二級和三級結構十分穩定,含有FMDV基因組RNA不同功能區及與細胞因子相互作用的位點[8]。小 RNA病毒通過IRES進行不依賴于帽子結構的方式起始翻譯,這解釋了為什么小RNA病毒的蛋白酶在沒有破壞自己基因組翻譯的前提下能關閉宿主細胞蛋白的合成。在 FMDV中,多肽鏈是在 IRES 3’端AU G及下游84nt處AU G兩個不同密碼子處起始翻譯[9]。引導蛋白酶(Leader proteinase,Lpro)是由 FMDV L基因編碼具有木瓜蛋白酶活性。其主要功能是Lpro能將自身從多肽鏈的C-末端切割下來,并降解宿主翻譯起始因子eIF4G[10],同時決定病毒的毒力[11],抑制Ⅰ型干擾素的翻譯[12]。

2 FMDV結構蛋白基因

FMDV結構基因 P1全長約2.2kb,含有1A、1B、1C和1D 4個基因,分別編碼 VP4、VP2、VP3和VP1。VP0是VP2和VP4的前體,VP1、VP2、VP3位于FMDV衣殼的表面,VP4位于衣殼的內部[13]。病毒衣殼蛋白的組成為:4種結構蛋白各一分子組成1個原體,每5個原體通過一種脲敏感結合區域聚集在一起,形成1個五聚體,12個五聚體借助組氨酸聚合形成病毒的空衣殼[14]。在 FMDV病毒衣殼表面VP1基因的第140～160位氨基酸組成的明顯突出衣殼表面的 G-H環,含有甘氨酸-精氨酸-天門冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD)三肽序列,其功能與纖維蛋白及整合素結合相關,是FMDV與細胞受體結合所必須序列[15]。研究發現RGD雖然是FMDV結合細胞所必須的序列,但不是特異性的序列,其他的病毒也有同樣的序列。RGD附近的基序是高度變異的,推測是這個高度的變異區和RGD高度保守區的結合才使得FMDV感染細胞具有特異性。研究表明RGD的受體是宿主細胞膜上的整聯蛋白(integrin),αVβ3是 FMDV的細胞受體[16-17]之一,除整聯蛋白外其他分子也能作為FMDV的受體,如硫酸乙酰肝素,近期研究還發現FMDV能夠不依賴αVβ3和乙酰肝素而進入細胞,這表明FMDV還有其他的類型的受體,能通過多種途徑進入細胞[18]。

3 FMDV非結構蛋白基因

FMDV非結構蛋白基因包括P2和P3編碼區,其中P2區編碼2A、2B、2C蛋白,P3區編碼3A、3B、3C和3D蛋白。

3.1 FMDV非結構蛋白P2基因 P2基因被裂解為2A、2B和2C,2A蛋白含有18個氨基酸的多肽,在多聚蛋白初級切割過程中,能通過自身切割與結構蛋白P1相分離。2B和2C蛋白位于內質網表面的小泡上具有輔助病毒誘導細胞病變作用,2C蛋白是膜結合蛋白,是起始負鏈RNA合成所必需的蛋白[19],2C蛋白具有ATPase和 GTPase活性,同時2C蛋白有助于新合成 FMDV衣殼的裝配,能誘使FMDV在細胞出芽式增殖[20-21]。

3.2 FMDV非結構蛋白P3基因 P3基因由3A、3B、3C、3D共同組成。3A具有膜相關性,被認為是小RNA病毒復制復合體與膜結構結合的錨定蛋白,與病毒誘導的細胞病理效應和阻斷宿主細胞內蛋白的分泌有關。1997年我國臺灣暴發的 FMDV分離株中發現了3A基因在C未端19至20氨基酸的缺失,降低了FMDV對牛的致病能力以及在牛源細胞上的生長能力。但是沒有直接的證據表示是由于3A基因的缺失才導致上述現象的出現[22]。

3B蛋白是由P3非結構蛋白編碼區3個相連但不完全相同的基因編碼,可以產生3種不同的3B蛋白(Vpg),這是RNA病毒中少有的核苷酸豐余現象[23]。VPg蛋白參與 RNA的起始合成以及在病毒RNA的衣殼形成中發揮重要的作用。由于VPg攜帶有pUpU結構與新合成的子代RNA相連,因此VPg被認為是小RNA病毒RNA合成的引物,這種特殊的RNA復制方式與宿主mRNA轉錄不同,因而在宿主 RNA合成受到抑制時,并不影響FMDV RNA的合成。VPg基因的拷貝數與RNA病毒的感染力呈正相關,VPg突變將導致病毒生命周期延長,這也意味著聚合蛋白合成和加工推遲,感染性粒子數目減少。

3C蛋白具有酶活性[24],FMDV大部分多聚蛋白的切割都是由它完成,同時3C在裂解宿主蛋白中起著重要的作用。脊髓灰質病毒3Cpro參與RNA聚合酶II介導的特異性轉錄因子的切割;在FMDV感染早期,3Cpro能切去組氨酸 H3N-未端20個氨基酸但被截斷的組氨酸仍然附著在染色體上[25]最近研究證實FMDV 3Cpro能切割具有RNA螺旋酶作用的eIF4A[26]。3D蛋白又稱 FMDV感染相關抗原(FMD-VIAA),是 FMDV毒編碼的 RNA多聚酶,核苷酸和氨基酸序列具有高度保守性,具有催化病毒RNA合成的功能。3D蛋白除具有RNA依賴的RNA聚合酶功能外,還具有VPg尿苷化,末端腺苷轉移酶及與3’U TR和3AB形成 RNP復合物的功能[27]。

4 FMDV 3’UTR

小核糖核酸RNA病毒基因組包括一個和3D蛋白酶相分離的Poly(A)區段而且能夠折疊成特殊的結構[28],平均長度一般在35～100個堿基;和細胞中的mRNA不同的是細胞中mRNA Poly(A)是轉錄后經修飾加入的,而小核糖核酸的 Poly(A)是基因組編碼的[29]。Poly(A)的存在能使 FMDV轉錄及時有效的終止。另外根據Poly(A)越短病毒感染性越低的特點,推測 Poly(A)可能與病毒的毒力有關。

[1]Brown F.Vaccination today and tomorrow[J].Biosci Rep,1995,15(6):493-502.

[2]Bull JJ,Meyers LA,Lachmann M.Quasispecies made simple[J].Plos Comput Biol,2005,1(6):450-460.

[3]Grubman MJ,Moraes MP,Segundo FDS,et al.Evading the host immune response:how foot-and-mouth disease virus has become an effective pathogen[J].Fems Immunol Med Mic,2008,53(1):8-17.

[4]Mason PW,Grubman MJ,Baxt B.Molecular basis of pathogenesis of FMDV[J].Virus Res,2003,91(1):9-32.

[5]Zibert A,Maass G,Strebel K,et al.Infectious foot-and-mouth disease virus derived from a cloned full-length cDNA[J].J Virol,1990,64:2467-2473.

[6]Clarke B E,Sangar D V,Burroughs J N,et al.Two initiation sites for foot-and-mouth disease virus polyprotein in vivo[J].J Gen Virol,1985,66:2615-2626.

[7]Lemon S M,Murphy P C,Shields P A,et al.Antigenic and genetic variation in cytopathic hepatitis A virus variants arising during persistent infection:evidence for genetic recombination[J].J Virol,1991,65:2056-2065.

[8]Macejak D G,Sarnow P.Internal initiation of translation mediated by the 5’leader of a cellular mRNA[J].Nature,1991,353:90-94.

[9]Meyer K,Petersen A,Niepmann M,et al.Interaction of eukaryotic initiation factor eIF-4B with a picornavirus internal translation initiation site[J].J Virol,1995,69:2819-2824.

[10]Beck E,Strohmaier K.Subtyping of european foot-and-mouth disease virus strains by nucleotide sequence determination[J].J virol,1987,61(5):1621-1629.

[11]Devaney M A,Vakharia V N,Lloyd R E,et al.Leader protein of foot-and-mouth disease virus is required for cleavage of the p220 component of the cap-binding protein complex[J].J Virol,1988,62:4407-4409.

[12]Mason P W,Rieder E,Baxt B.RGD Sequence of foot-andmouth disease virus is essential for infecting cells via the natural receptor but can be bypassed by an antibody-dependent enhancement pathway[J].Proc Nal Acad SciUSA,1994,91:1932-1936.

[13]Brown C C,Chinsangaram J,Grubman M J.Type I interferon production in cattle infected with 2 strains of foot-and-mouth disease virus,as determined by in situ hybridization[J].Can J Vet Res,2000,64:130-133.

[14]Ryan MD,Belsham GJ,King AM.Specificity of enzymesubstrate interactions in foot-and-mouth disease virus polyprotein processing[J].Virology,1989,173(3):35-45.

[15]謝慶閣.口蹄疫[M].北京:中國農業出版社,2004.

[16]Leippert M,Beck E,Weiland F,et al.Point mutations within the(G-(H loop of foot-and-mouth disease virus O1K affect virus attachmentto targetcells[J].J Virol,1997,71:1046-1051.

[17]Berinstein A,Roivainen M,Hovi T,et al.Antibodies to the vitronectin receptor(integrinαvβ3)inhibit binding and infection of foot-and-mouth disease virus to cultured cells[J].J Virol,1995,69:2664-2666.

[18]Jackson T,Ellard F M,Ghazaleh R A,et al.Efficient infection of cells in culture by type O foot-and-mouth disease virus requires binding to cell surface heparan sulfate[J].J Virol,1996,70:5282-5287.

[19]Baranowski E,Ruiz-Jarabo,Sevilla N,et al.Cell recognition by foot-and-mouth disease virus that lacks the RGD integrinbinding motif:flexibility in aphthovirus receptor usage[J].J Virol,2000,74:1641-1647.

[20]Barton D J,Flanegan J B.Synchronous replication of poliovirus RNA:initiation of negative-strand RNA synthesis requires the guanidine-inhibited activity of protein 2C[J].J Virol,1997,71:8482-8489.

[21]Bienz K,Egger D,Pfister T,et al.Structural and functional characterization of the poliovirus replication complex[J].J Virol,1992,66:2740-2747.

[22]Andino R,Rieckhof G E,Baltimore D.A functional ribonucleoprotein complex forms around the 5’end of poliovirus RNA[J].Cell,1990,63:369-380.

[23]Knowles N J,Davies P R,Henry T,et al.Emergence in Asia of foot-and-mouth disease viruses with altered host range:characterization of alterations in the 3A protein[J].J Virol,2001,75:1551-1556.

[24]King AM,Sangar DV,Harris TJ,et al.Heterogeneity of the genome-linked protein of foot-and-mouth disease virus[J].J Virol,1980,34(5):627-634.

[25]Klump W,Marquardt O,Hofschneider P H.Biologically active protease of foot and mouth disease virus is expressed from cloned viral cDNA in Escherichia coli[J].Proc Natl Acad Sci USA,1984,81:3351-3355.

[26]Grigera P R,Tisminetzky S G.Histone H3 modification in BHK cells infected with foot-and-mouth disease virus[J].Virology,1984,136:10-19.

[27]Belsham GL,McInerney G M,Ross-Smith N.Foot-and-mouth disease virus 3C protease induces cleavage of translation initiation factors eIF4A and eIF4G within infected cells[J].J Virol,2000,74:272-280.

[28]Plotch S J,Palant O.Poliovirus protein 3AB forms a complex with and stimulates the activity of the viral RNA polymerase,3Dpol[J].J Virol,1995,69(11):7169-7179.

[29]Pilipenko E V,Blinov V M,Romanova L I,et al.Conserved structural domains in the 5’-untranslated region of picornaviral genomes:an analysis of the segment controlling translation and neurovirulence[J].Virology,1989,168:201-209.