羊痘病毒屬病毒ORF132的克隆及序列分析＊

丁 森,聶福平,王 昱,肖進文,周雪梅,肖 雯,黃 鶴,劉生峰,周 慶,李應國,蔡家利

痘病毒科(Poxiridae)羊痘病毒屬(Capripoxvirus,CPV)主要包括山羊痘病毒(Goatpox Virus,GTPV)、綿羊痘病毒(Sheeppox Virus,SPPV)和疙瘩皮膚病病毒(Lumpy Skin Disease Virus,LSDV)三種[1-5]。山羊痘、綿羊痘病毒引起的羊痘(Capripox)又名羊“天花”,是羊的一種急性、熱性、接觸性傳染病,包括綿羊痘(Sheeppox,SP)和山羊痘(Goatpox,GP)。主要表現為發熱,無毛或少毛部位的皮膚或黏膜發生紅斑、丘疹、皰疹、水泡(少數)、內臟病變(特別是肺)[6]。疙瘩皮膚病病毒引起疙瘩皮膚病(Lumpy skin disease,LSD)是以患牛發熱,皮膚、黏膜、器官表面廣泛性結節,淋巴結腫大,皮膚水腫為特征的傳染病。該病又稱結節性皮炎或塊狀皮膚病,能引起感染動物消瘦,產乳量大幅度降低,嚴重時導致死亡。

GTPV和SPPV基因組約有150 kb,共有147個開放閱讀框(Open reading frame,ORF)。2001年美國科學家報道了LSDV的基因組序列,其基因組長145 kb～152 kb[7],基因組中沒有發卡環結構,核苷酸組成中含有73%A+T,呈有規律的均勻分布。但是,三種病毒基因間的同源性非常高,如要對三種病毒進行基因水平的檢測,必須找到針對三種病毒的特異性基因序列。通過全基因比對,發現三者的ORF132基因具有較好的特異性。因此對其進行克隆分析,以期對后續研究有所幫助。

1 實驗材料

山羊痘病毒株;綿羊痘病毒株;疙瘩皮膚病疫苗株;疙瘩皮膚病野毒株DNA;山羊睪丸原代細胞由實驗室自行制備;MEM培養基購自Invitrogen公司;鏈-青霉素雙抗、胎牛血清購自 Thermo公司;DNA提取試劑盒、質粒提取試劑盒購自Omega公司;膠回收試劑盒,載體連接試劑盒購自大連寶生物公司;JM109感受態細胞由重慶出入境檢驗檢疫局技術中心實驗室提供。引物由寶生物(大連)公司合成。

2 實驗方法

2.1 病毒培養和核酸提取 15天左右的雄性羊只,綁定,處死。無菌操作下,止血鉗夾住精索,剝離睪丸,去掉外層的膜,游離的睪丸,含10×雙抗 PBS清洗睪丸,鑷子撕去掉白色的薄膜,盡量干凈,把睪丸置于小燒杯中,眼科剪刀剪碎20 min;加無血清培養液DMEM(10×雙抗),用20mL針頭注射器反復吹打20次,用200或300目不銹鋼濾網過濾,沉淀一下,吸取上層的細胞;剩下的再吹打,過濾,吸取上層的細胞,清洗2次,3 000r/min,5min;分裝,加含雙抗(2×),10%胎牛血清的MEM培養基15 mL～20 mL;2～3 d后換液。待細胞長成單層后,準備接毒。棄去細胞瓶內原有培養液,無血清DMEM清洗1次;50μL種毒加450μL維持液(含2%胎牛血清,1%雙抗的MEM)混勻后加入到細胞瓶中;搖晃均勻,37℃吸附1h,期間每20min搖晃一次;1h后補充4.5mL維持液;37℃CO2恒溫培養箱培養,觀察侵染結果。山羊痘、綿羊痘、疙瘩皮膚病病毒、陰性對照各一瓶;病變達75%以上時,收毒。取出細胞瓶,封口,置-70℃冰箱凍實后,取出室溫融化,反復3次,使細胞釋放病毒。取山羊痘、綿羊痘和疙瘩皮膚病病毒細胞培養液各200μL,提取DNA,進行PCR擴增,10g/L瓊脂糖凝膠電泳。

2.2 基因的克隆和測序 山羊痘病毒ORF132基因 上 游 引 物 ,5′-ACAAACACTTCCCTCCTTAAGCTACT-3′,擴增位置 ,4bp-465bp;綿羊痘病毒ORF132基因上游引物,5′-GACGAACATTTTTCCCTCTAAGCTAC-3′,擴增位置 ,4bp-494bp;疙瘩皮膚病病毒 ORF132基因上游引物,5′-A TGACAAA YACTTCCCTCCTTTTAAGC-3′,擴 增 位置 ,4bp-498bp;通 用 下 游 引 物 ,5′-ATCTCCATGNGAAACTTTACAAA-3′。PCR體系:10×PCR Buffer 2.5μL,2.5 each mmol/L dN TP Mix 1μL;25 mmol/LMgCl22μL,Taq 聚 合 酶 (5U/μL)0.4μL,上 游 引 物 (10μmol/L)1μL,下 游 引 物(10μmol/L)1μL,DNA 模版 5μL,補充滅菌蒸餾水至25μL。反應條件:95℃預變性 5min,95℃變性40s,50℃退火1min,72℃延伸 1min,進行 35個循環;72℃補充延伸8min。將 GTPV、SPPV及LSDV的PCR產物連接于19-T載體并轉化入JM109感受態細胞,選取PCR鑒定陽性的克隆質粒各兩個,送至大連寶生物公司進行測序。

2.3 序列分析 利用相應軟件對測序基因進行同源性分析。

3 實驗結果

3.1 接種三種病毒后山羊睪丸細胞病變圖 細胞貼壁的過程中,細胞形態有圓形逐漸變為不規則的多邊形,長梭型,呈纖維狀存在。接種病毒3天后細胞病變明顯:與對照組比較后發現,山羊痘病毒可使山羊睪丸細胞產生皺縮,綿羊痘病毒可使細胞出現結節狀聚集和死亡漂浮,疙瘩皮膚病病毒主要使細胞出現結節狀聚集。(圖1,2,3)

3.2 陽性質粒PCR鑒定電泳圖(圖4)。

3.3 同源性分析

3.3.1 四種病毒基因比對(圖5)。

3.3.2 基因網上比對 測序結果在NCBI網站進行Blast比對后發現該山羊痘病毒與山羊痘病毒G20-L KV株、Pellor株有95%的相似性;綿羊痘病毒與綿羊痘病毒A株、NISKHI株有98%的相似性與10700-99 strain TU-V02127株有 97%的相似性;疙瘩皮膚病疫苗株與isolate Neethling vaccine LW 1959株有 99%的相似性,與 NI-2490 isolate Neethling2490株、NW-LW isolateNeethling Warmbaths LW株有97%相似性;疙瘩皮膚病野毒株與NI-2490 isolate Neethling 2490株、NW-LW isolate Neethling Warmbaths LW株有99%相似性,與isolate Neethling vaccine LW 1959株有96%的相似性(圖6)。

4 討 論

羊痘是所有動物痘病中最為嚴重的一種,發病后成羊死亡率40%,羔羊死亡率100%,有本病的國家和地區的易感動物及其相關產品被世界各國列為嚴格限制進出的對象,嚴重影響國際貿易和養羊業的發展[8-10]。中國[11-12]、瑞典、印度[13]依據流行病學和臨床癥狀都有人類感染羊痘病毒的報道,因此,研究該病在公共衛生方面有重要意義。羊痘病毒(SGPV)還可作為生物武器,成為世界恐怖分子威脅世界和平的有力手段,被劃歸到Ⅱ類危險戰劑。世界動物衛生組織(OIE)將該病定為法定通報疾病,我國將其列為Ⅰ類動物疫病[10,14]。疙瘩皮膚病起源于非洲,并于1989年和2006年在以色列發生,顯示該病已逃逸出非洲大陸,有不斷蔓延的趨勢[1]。各種牛均易感,死亡率能達到3%～85%,給經濟帶來較大的損失。

但是,目前世界各國都還未有較為可靠的檢測該屬病毒的方法,使進出口檢驗檢疫處于被動地位。為嚴格防止該類病的傳入,盡早檢出,減少損失,建立快速高效,操作簡便,成本低廉的 GTPV、SPPV及LSDV檢測方法迫在眉睫。

基于此,對 GenBank上公布的山羊痘、綿羊痘及疙瘩皮膚病各個開放閱讀框的基因序列,進行比對后發現,ORF132基因相對于其他開放閱讀框有較大的特異性,可作為目的基因建立分子生物學檢測方法。可以此為特征序列設計引物進行PCR鑒定以及設計探針進行基因芯片檢測該屬病毒。建立一整套該屬病毒的分子診斷技術平臺,對滿足進出境動物檢疫工作的需要,控制羊痘傳播,并防止牛疙瘩皮膚病由境外向我國擴散,保障我國的畜牧業健康、安全發展具有十分重要的意義。

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