多發性乳腺纖維腺瘤患者免疫組化相關指標的研究

張秀俠 樓麗華 張 慶

1 浙江省杭州市余杭區第一人民醫院普外二科 311000; 2 浙江省中醫院乳腺病診療中心

多發性乳腺纖維腺瘤患者免疫組化相關指標的研究

張秀俠1樓麗華2張 慶1

1 浙江省杭州市余杭區第一人民醫院普外二科 311000; 2 浙江省中醫院乳腺病診療中心

目的：探討多發性乳腺纖維腺瘤的病因和發病機理,研究免疫組化法檢測的相關指標在本病發生過程中的意義。方法：用免疫組化法檢測90例多發性乳腺纖維腺瘤患者和30例乳腺增生病患者乳腺組織中雌激素受體(estrogen receptor,ER)、孕激素受體(progesterone receptor,PR)、細胞增殖抗原標記物(K i-67)、抑癌基因P53及人類癌基因CerbB-2的表達。結果：(1)多發性乳腺纖維腺瘤患者PR的陽性表達率及高強度陽性表達率均高于對照組(前者P＜0.01,后者P＜0.05);K i-67的陽性表達率明顯高于對照組(P＜0.05);(2)多發性乳腺纖維腺瘤患者ER、PR之間有顯著相關性(P＜0.01);(3)多發性乳腺纖維腺瘤患者ER的陽性表達率與對照組相比無顯著性差異(P＞0.05); (4)多發性乳腺纖維腺瘤患者ER、PR與K i-67的表達之間無相關性(P＞0.05);(5)P53和CerbB-2在本病中均無表達。結論：(1)局部乳腺組織中PR的陽性表達率及陽性表達強度升高也是乳腺纖維腺瘤發病的主要因素;(2)ER、PR間存在的相關性在本病的發生中起了主要作用;(3)Ki-67的陽性表達率升高,說明細胞增殖能力較強,這可能也是本病發生的直接原因。

多發性纖維腺瘤 乳腺腫瘤 免疫組織化學

乳腺纖維腺瘤(fibroadenoma of breast)又稱乳腺纖維瘤,是由乳腺纖維組織和腺管兩種成分增生共同構成的乳房良性腫瘤,其發病率在乳腺良性腫瘤中居首位。乳腺纖維腺瘤可發生于青春期后任何年齡的女性,但以20～25歲的年輕女性多見,絕經后婦女較少見。表現為扁圓或卵圓形的無痛性腫塊,質實韌,活動度較好,腫塊不隨月經周期而變化。一般為單發腫物,約20%～25%為多發。

多發性乳腺纖維腺瘤是指同時或先后發生于乳房同側或雙側的2個以上的纖維腺瘤。多發性乳腺纖維腺瘤患者在多次手術后,不但乳房內部結構(如乳導管、腺體等)受到破壞,乳房的外部形態也會受到影響,進而給患者的身心造成損害。并且,術后復發的病例惡變率相對升高;妊娠期由于體內雌、孕性激素的大量增加,也可刺激腺瘤迅速增長,甚至可能誘發肉瘤變。所以,了解多發性乳腺纖維腺瘤的發病原因及發病機理,進而制定正確的預防措施和治療方法就顯得相當重要。

現代醫學認為乳腺纖維腺瘤的發病原因尚不明確,一般認為其發病主要與患者體內性激素水平及乳腺組織局部雌、孕激素受體的量或質的異常有關。目前,國內外對于乳腺纖維腺瘤多發性的原因及機制的研究尚鮮見于文獻報道,本文主要從免疫組化法檢測所得的相關激素受體及基因方面探討多發性乳腺纖維腺瘤的發病機制,從而為進一步研究和治療本病提供理論依據和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集乳腺病住院患者120例。根據患者術后病理診斷結果,將收集的病例分為多發性乳腺纖維腺瘤組90例(其中,同時多發者63例,異時多發者27例;發于單側乳房者25例,發于雙側乳房者65例),平均年齡(30.58±8.07)歲;乳腺增生組30例,平均年齡(40.07±7.00)歲。入選標準如下：(1)非妊娠期、非哺乳期、無肝病及內分泌失調疾病、月經基本正常、近期內未服用過避孕藥或其他激素類藥物。(2)術后經病理診斷為(多發性)乳腺纖維腺瘤、乳腺增生病。(3)有完整的臨床資料。

1.2 免疫組織化學法檢測 經病理診斷為(多發性)乳腺纖維腺瘤、乳腺增生病患者的手術標本,分別進行免疫組化指標ER、PR、Ki-67、P53、CerbB-2的檢測。(1)實驗試劑：1∶10多聚賴氨酸、ER單克隆抗體(鼠抗人)、PR單克隆抗體(鼠抗人)、Ki-67單克隆抗體(鼠抗人)、P53單克隆抗體(鼠抗人)、CerbB-2單克隆抗體(鼠抗人)、DAB試劑盒(購自北京中山生物技術有限公司)。(2)實驗方法及步驟：①玻片處理：徹底清洗,烤干后1∶10多聚賴氨酸涂抹玻片,風干。②標本處理：將手術切除的標本浸于10%甲醛溶液中,取材后,石蠟包埋,蠟塊標本做4μm的連續切片數張,撈片。③設立實驗對照：陽性對照：以確診的陽性標本作為陽性對照。陰性對照：用PBS替代一抗,其余染色同。④免疫組化：(兩步法)檢測。⑤結果判定：用Olym pus顯微鏡觀察,高倍鏡下計數4個隨機視野,每個視野計數100個細胞,計算染色陽性的細胞占所計數細胞的百分比,按各視野計數的平均值結合染色強度作最后判定。ER、PR、Ki-67、P53陽性染色均位于胞核,或胞漿、胞核同時染色,以胞核染色為主,僅胞漿染色計為陰性,染色強度分為3級：1淺棕色;3深褐色;2介于1和 3之間。綜合染色強度和表達率,ER、 PR、Ki-67、P53的判定標準為：(-)：完全陰性; (±)：陽性細胞比例＜10%;(+)：陽性細胞比例10%～25%;(++)：陽性細胞比例26%～50%; (+++)：陽性細胞比例51%～100%。二分法以10%為閾值確定陰性和陽性。CerbB-2陽性細胞為膜著色,不著色為陰性(-);著色陽性細胞數＞10%為陽性,其中著色弱且不連續為弱陽性(+),著色中等部分不連續為陽性(++),著色強且連續為強陽性(+++)。(3)實驗設備：Leica全自動脫水機、BM-IV生物組織冷凍包埋機、Leica RM2135型全自動切片機、PHY-Ⅲ病理組織漂烘處理儀、Olympus U-B130多頭光學顯微鏡及高壓鍋、恒溫烤箱、10m l吸管、高精度加液器及吸頭、染色缸、保濕孵育盒、擦拭紙、蓋玻片、可調計時器等。

1.3 統計學處理 采用SPSS11.5統計軟件進行統計學分析。數據資料用±s(均數±標準差)表示,兩組間數據比較用t檢驗,計量資料用χ2檢驗。檢驗以P＜0.05或P＜0.01為差異顯著的標準。

2 免疫組織化學法檢測結果

2.1 兩組間ER、PR、Ki-67陽性表達率比較 兩組患者免疫組化檢測,P53、CerbB-2均為陰性,無1例表達,統計學比較無顯著差異。ER、PR、Ki-67結果的比較和統計見表1及圖1。

表1 多發性乳腺纖維腺瘤組與乳腺增生組ER、PR、Ki-67的陽性表達率比較

圖1 多發性乳腺纖維腺瘤與乳腺增生患者ER、PE、K i-67陽性率對比

由表1、圖1可見：多發性乳腺纖維腺瘤患者與增生組相比,雌、孕激素受體及Ki-67的陽性表達率均高于增生組。PR有非常顯著差異(P＜0.01), Ki-67有顯著差異(P＜0.05),ER無統計學差異。

2.2 兩組間ER、PR、Ki-67的陽性表達強度 多發性乳腺纖維腺瘤患者ER、Ki-67的陽性強度主要表現在(+),與增生組一致;而PR的陽性強度主要表現在(++),與增生組相比有顯著差異(P＜0.05)。 見表2、圖2、圖3。

表2 ER、PR、Ki-67的陽性表達強度比較

圖2 多發性纖維腺瘤患者ER、PR、K i-67陽性表達圖

圖3 乳腺增生病患者ER、PR、K i-67陽性表達圖

2.3 兩組ER、PR、Ki-67的高陽性強度(++～+ ++)表達率比較 多發性乳腺纖維腺瘤患者ER、PR、Ki-67高強度陽性表達率與增生組相比,均高于增生組。其中PR的陽性高表達率比較有顯著差異(P＜0.05),兩組間ER及Ki-67的比較均無統計學差異。見表3、圖4。

表3 ER、PR、K i-67的高陽性強度(++～+++)表達率比較

圖4 多發性乳腺纖維腺瘤與乳腺增生患者ER、PR、K i-67陽性高表達率對比

2.4 ER、PR、Ki-67相關性 多發性乳腺纖維腺瘤患者ER、PR的表達有非常顯著相關性(P＜0.01)。多發性乳腺纖維腺瘤患者 ER、PR的表達與K i-67的表達之間無相關性(P＞0.05)見表4、5。

3 分析與討論

表4 多發性乳腺纖維腺瘤患者ER、PR的相關性(n=90)

表5 多發性乳腺纖維腺瘤患者ER、PR與Ki-67的相關性(n=90)

3.1 現代醫學對乳腺纖維腺瘤發病機理的認識現代醫學認為乳腺纖維腺瘤的發病原因尚不明確,大多數學者認為乳腺纖維腺瘤的發病原因主要與雌、孕激素分泌平衡失調,雌激素絕對或相對升高,而孕激素絕對或相對降低,致使孕激素不能制約雌激素對乳腺組織的過度刺激,以及乳腺局部組織對激素作用過度敏感有關。但有關乳腺纖維腺瘤存在多發性的原因尚未有見于文獻報道。

3.2 多發性乳腺纖維腺瘤患者免疫組織化學相關指標分析 本病與乳腺增生病同屬于乳腺組織的增生類疾病,乳腺增生病又稱乳腺結構不良,是乳腺主質和間質不同程度地增生與復舊不全所致的乳腺結構在數量和形態上的異常。本病由乳腺纖維組織和腺管的過度增生所致,乳腺增生病是由乳腺主質和間質的彌漫性增生引起。故本研究在進行免疫組化檢測過程中,把乳腺增生組與多發性乳腺纖維腺瘤組進行對照觀察,旨在發現多發性乳腺纖維腺瘤患者乳腺局部組織中免疫組化相關指標的特殊表達。

免疫組織化學又稱免疫細胞化學,是指帶顯色劑標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應和組織化學的呈色反應,對相應抗原進行定性、定位、定量測定的一項新技術。它把免疫反應的特異性、組織化學的可見性巧妙地結合起來,借助顯微鏡的顯像和放大作用,在細胞、亞細胞水平檢測各種抗原物質(如蛋白質、多肽、酶、激素、病原體以及受體等)。

性激素作用是通過與其受體結合而產生的,雌、孕激素只有通過與其靶細胞內的ER、PR相結合,才能發揮其對乳腺組織的生物學效應,同時,乳腺局部實質成分性激素受體質和量的異常,可導致這些部位對激素的反應異常,局部刺激過度,則可引起纖維腺瘤的發生。所以,檢測ER、PR的陽性表達率及表達強度對探討本病的發病原因有著十分重要的意義。

本研究顯示,多發性乳腺纖維腺瘤患者ER陽性表達率及其高強度陽性表達率與增生組相比均無明顯統計學意義(P＞0.05);PR陽性表達率93.33%,明顯高于增生組的66.67%,有非常顯著差異(P＜0.01);PR的高強度陽性表達率為62.22%,也顯著高于增生組的26.67%,有非常顯著差異(P＜0.01),多發性乳腺纖維腺瘤患者的陽性強度表現在(++),說明PR在多發性乳腺纖維腺瘤患者乳腺組織中的表達有著重要的意義。同時,研究顯示：多發性乳腺纖維腺瘤患者ER、PR同時陽性表達的有68例,所占百分比為75.56%,統計結果還表明, ER和PR之間有直線相關性。有研究認為,PR是由雌激素誘導合成的,PR的表達說明細胞內ER的作用機制是完整的,其ER為功能性ER,PR的存在依賴于ER[1,2]。基于此,本研究證實：多發性乳腺纖維腺瘤患者的ER絕大多數為功能性ER,與臨床研究結果[3]一致。Ki-67是在增殖細胞中表達的一種核抗原,存在于細胞周期中除G0期以外的所有階段,與細胞的合成代謝有關,也是目前較為肯定的核增殖標志物[4]。故觀察該指標在乳腺纖維腺瘤中的表達對于探討本病的發病機制有著重要的意義。本研究發現,多發性乳腺纖維腺瘤患者Ki-67陽性表達的有31例,占研究總人數的34.44%,與增生組相比有顯著差異(P＜0.05),由此可見,多發性乳腺纖維腺瘤患者細胞增殖能力較強,這也正是本病多發性的一個直接而主要的原因。本實驗統計顯示Ki-67陽性表達強度與增生組比較無統計學差異(P＞0.05)。有研究表明乳癌患者Ki-67的陽性表達與ER、PR陽性表達之間無顯著相關性[4]。在本研究中,K i-67的表達與ER、PR之間也沒有相關性。以上結果證明,患者的細胞增殖狀態不受乳腺局部組織性激素受體量的影響,與受體表達無關。P53位于17號染色體短臂上,野生型P53基因抑制細胞轉化,并能抑制癌基因的活動,而突變型P53基因可引起細胞的轉化和癌變,使細胞無限增生[5]。野生型P53的蛋白量很低,半衰期短,只有20～30m in,而突變型P53的半衰期可達1.4～8h,在細胞內存積穩定,故用免疫組化方法在組織內實際檢測到的P53均為突變型P53[6]。CerbB-2是一種細胞來源的癌基因,正常情況下處于非激活狀態(又稱原癌基因),參與細胞生長、分化的調節,當受到體內外某些因素作用而被激活時,具有腫瘤轉化活性[4]。由于本病多發性的存在,導致其惡變率相對升高,故對多發性乳腺纖維腺瘤患者病變組織中P53及CerbB-2的檢測也有重要意義。本研究也對P53和CerbB-2進行了檢測與觀察,旨在探討其在多發性乳腺纖維腺瘤患者中有無特殊表達和意義,結果顯示均為陰性,無1例表達,說明多發性乳腺纖維腺瘤患者細胞增殖能力雖然較強,但細胞分化無異常,細胞增生有度。

4 結論

本文應用現代研究方法從免疫組化方面研究了90例多發性乳腺纖維腺瘤患者病變組織ER、PR、Ki-67、P53及CerbB-2的表達情況。結果顯示,多發性乳腺纖維腺瘤患者ER、PR的表達之間存在直線相關性,且兩者均為陽性的比例也高于增生組,說明本病的發生與雌、孕激素分別與其受體相結合而共同發揮其生物學效應有關;多發性乳腺纖維腺瘤患者局部乳腺組織 Ki-67陽性表達率明顯高于增生組,說明本病患者細胞增殖能力較強,這也是纖維腺瘤多發的一個直接而主要的原因。多發性乳腺纖維腺瘤患者ER、PR與Ki-67之間無相關性,說明本病患者細胞增殖活性與性激素受體的表達無關。P53、CerbB-2在多發性乳腺纖維腺瘤患者病變組織中的表現均為陰性,說明多發性乳腺纖維腺瘤患者細胞增殖能力雖然較高,但細胞分化尚無異常。

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The Study on the Relative Immunohistochem ical Index in the Patientwith Multip le Fibroadenoma of Breast

ZHANGXiuxia＊,LOU Lihua,ZHANGQing.＊DepartmentofGenaralSurgery,theYuhangDistrictFirstPeople's HospitalofHangzhouCity,ZhejiangProvince311000

Objective：To exam ine the pathogenesis o fmu ltiple fibroadenoma of breast and discuss the significance of immunohistochem ical indicatrix in the process of the disease.Methods：The expression of estrogen receptor(ER),progesterone recep tor(PR),the cell p ro liferating antigen Ki-67,anti-oncogene P53 and human oncogene CerbB-2 were tested by the immunohistochem ical assay in 90 cases withmu ltiple fibroadenomao f breastand 30 cases withmammary hyperp lasia.Results：(1)The positive rate and the pow erful positive rate of PR expression were both higher than that in healthy control group significantly(respective lyP＜0.01,P＜0.05).(2)There was significant dependability between ER and PR in the cases withmu ltip le fibroadenoma of breast(P＜0.01).(3)There was no significant dependability for the positive rate of ER expression betw een the caseswith multiple fibroadenoma of breast and the controlgroup(P＞0.05).(4)There was no significant dependab lity between the exp ression of ER and PR and the exp ression of K i-67(P＞0.05).(5)There was no expression of P53 and CerbB-2 in the cases with multip le fibroadenoma of breast.Conclusion：(1)The increase of the positive rate and the pow erfu l positive rate of PR exp ression in mammary g land partly is themajor factor for themu ltip le fibroadenoma of breast.(2)The dependability betw een ER and PR make an im portant role in the disease.(3)The increaseof the positive rate of Ki-67 expression prove that the cells'reproductiveactivity is strong,and perhaps this is the immediate cause which induce the disease.

Multip le fibroadenoma,Breast tumor,Immunohistochem ical

R737.9

A

1001-7585(2011)10-1117-04

2011-03-25

(編輯江山)

論 著