睡蓮花總黃酮超聲提取工藝研究

金曉紅，耿偉，桂紅武

(1.浙江省諸暨市人民醫院藥劑科，311800;2.新疆醫科大學第一附屬醫院藥學部，烏魯木齊 830054;3.新疆維吾爾自治區人民醫院北院，烏魯木齊 830054)

睡蓮花為睡蓮科(Nymphaeceae)植物雪白睡蓮(Nymphaea candida Presl.)的干燥花，具有清熱解毒、鎮靜安神作用。主要用于小兒急、慢驚風，以及熱癥引起的頭痛、熱感、咳嗽。在維吾爾族民間用藥歷史悠久，是維吾爾醫常用的單方或復方抗病毒藥中的主要成分［1-2］。筆者研究了睡蓮花化學成分，發現其主要化學成分為蘆丁、槲皮素、山萘酚、異槲皮苷等黃酮類化合物和小分子酚類物質。黃酮類化合物的生物活性廣泛而溫和，具有抗菌、消炎、抑制血小板聚集、抗凝及抗血栓形成等作用。筆者在本實驗中采用單因素實驗及正交實驗法考察乙醇濃度、料液比、提取時間、提取次數對睡蓮花總黃酮超聲提取效果的影響，以確定其最佳超聲提取條件，從而為合理開發利用睡蓮花資源提供科學依據［3-4］。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 紫外分光光度儀(SHMADZU，UV-2501PC)，電子天平(Sartorliux)，超聲提取儀(天津奧特賽恩斯儀器有限公司，AS10200BDT)，真空干燥儀(上海精宏儀器設備有限公司，DZF-6050型)。

1.2 材料 睡蓮花(產自新疆阿克蘇，提取前先進行曬干、粉碎處理)，蘆丁對照品(中國藥品生物制品檢定所提供，批號:100080-200306)，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 標準品溶液的制備 精密稱取120℃減壓干燥至恒質量的蘆丁對照品50.33 mg，置于25 mL量瓶，加入甲醇溶解稀釋至刻度，作為儲備液。吸取5 mL置50mL量瓶，加入甲醇稀釋定容，制成0.201 32 mg·mL-1對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備 取睡蓮花藥材5 g，以溶劑提取，將提取液過濾、濃縮、真空干燥(70℃)。精密稱取浸膏200 mg，置100 mL量瓶，加入適量甲醇，超聲溶解3 min，用甲醇定容，過濾。精密量取續濾液3 mL置50 mL量瓶，用甲醇定容至刻度，作為供試品溶液，按標準曲線項下的方法測定藥材中黃酮含量。

2.3 標準曲線的繪制 精密吸取對照品溶液 1.0，3.0，5.0，7.0，9.0 mL，分別置 25 mL 量瓶，加入 5% 亞硝酸鈉溶液1.0 mL放置6 min，加10%硝酸鋁1.0 mL放置6 min，加入4%氫氧化鈉10.0 mL，用純化水稀釋至刻度搖勻，放置10 min，在508 nm波長處測定吸光度，以濃度 (X)為橫坐標，吸光度 (Y)為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程為:Y=0.437 2X+0.295 3(r=0.999 4)。結果表明，蘆丁濃度在 0.201 32 ～1.811 9 mg·mL-1范圍內與吸光度線性關系良好。

2.4 超聲條件下不同因素對黃酮類化合物提取率的影響

2.4.1 乙醇濃度對黃酮類化合物提取率的影響 在5 g藥材粉末中，分別加入15倍量50%，60%，70%，80%，90%乙醇超聲提取15 min，按“2.2”項方法測定藥材中總黃酮含量，結果見圖1。

由圖1可知，隨著乙醇濃度的升高，睡蓮花總黃酮提取率呈上升趨勢，乙醇濃度為70%時提取率最高。但當濃度進一步增加，提取率反而降低。

2.4.2 乙醇用量對黃酮類化合物提取率的影響 在5 g藥材粉末中分別加入 70% 乙醇 40，60，80，100，120 mL，超聲提取15 min，按“2.2”項方法測定藥材中總黃酮含量，結果見圖2。

圖2 乙醇用量對總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of ethanol dosage on extraction rate of total flavonids

由圖2可知，睡蓮花總黃酮提取率隨溶劑用量增加而增加，乙醇用量16倍時提取率最高。

2.4.3 超聲提取時間對黃酮類化合物提取率的影響

在5 g藥材粉末中分別加入15倍量70%乙醇，超聲處理10，20，30，40，50 min，按“2.2”項方法測定藥材中總黃酮含量。結果見圖3。

圖3 超聲提取時間對藥材中總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extaction rate of total flavonoids

從睡蓮花總黃酮的提取效果看，隨著提取時間從10到60 min，提取開始階段，總黃酮的提取率隨提取時間的延長而增加較快，在30 min時達最高;提取后期提取速度逐漸減慢，提取率呈下降趨勢。

2.4.4 超聲功率對黃酮類化合物提取率的影響 在5 g藥材粉末中加入15倍量70%乙醇，超聲功率分別為 30，90，150，210，270 W，超聲處理 30 min，按“2.2”項方法測定藥材中總黃酮含量。結果見圖4。

圖4 超聲功率對藥材中總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic extraction power on extaction rate of total flavonoids

圖4表明，在頻率、時間和溫度固定時，超聲波的電功率對維藥睡蓮花總黃酮的提取率影響不大。

2.4.5 提取次數對黃酮類化合物提取率的影響 在5 g藥材粉末中分別加入15倍量70%乙醇，超聲處理1，2，3，4，5 次，按“2.2”項方法測定藥材中總黃酮含量，結果見圖5。

圖5 提取次數對藥材中總黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of extraction times on extaction rate of total flavonoids

由圖5可以看出，睡蓮花中總黃酮的提取率隨提取次數的增加而呈上升趨勢。

2.4.6 正交實驗及其結果 在上述單因素實驗的基礎上采用正交實驗法，以乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時間(C)、提取次數(D)為4因素，各取3個水平，按照L9(34)正交表進行乙醇超聲提取實驗，測定睡蓮花總黃酮的含量，作為考察指標，并對此進行統計學處理。直觀分析結果表明，提取次數對實驗的影響最大，其次是乙醇濃度和提取時間，影響最小的是料液比。方差分析結果表明乙醇濃度、超聲提取時間、超聲提取次數對睡蓮花中黃酮的提取影響都很顯著，料液比對其影響較小。結合節約成本方面綜合考慮，確定超聲提取睡蓮花中黃酮的最佳工藝是A3B2C2D3，即16倍量的80%乙醇超聲提取5次，每次提取30 min。因素水平見表1，正交實驗結果見表2，方差分析結果見表3。

表1 正交實驗因素水平表Tab.1 Factors and levels of orthogonal test

表2 正交實驗結果Tab.2 Results of orthogonal test

2.4.7 驗證實驗 根據篩選得到的最佳工藝(A3B2C2D3)進行驗證實驗，3份藥材樣品中總黃酮含量分別為1.42%，1.35%及1.58%。結果表明，提取工藝穩定，重復性良好。

2.5 不同提取方法提取率比較

表3 方差分析表Tab.3 Variance analysis of orthogonal test

2.5.1 水煎煮法 稱取藥材粉末5 g，加入16倍水煎煮2次，每次30 min，提取液合并、濃縮、干燥。

2.5.2 回流提取法 稱取藥材粉末5 g，加入16倍80%乙醇回流提取2次，每次30 min，提取液合并、濃縮、干燥。

2.5.3 超聲提取法 稱取藥材粉末5 g，加入16倍80%乙醇超聲提取2次，每次30 min，提取液合并、濃縮、干燥。

2.5.4 結果比較 將上述干燥提取物按“2.2”項方法測定藥材中總黃酮的含量。結果水煎煮法藥材中總黃酮含量為0.21%，回流提取法為0.44%，超聲提取法為1.02%，即超聲提取法效果最佳。

3 討論

筆者在本實驗中研究睡蓮花總黃酮的提取工藝，單因素及正交實驗結果顯示乙醇濃度、乙醇用量及超聲提取時間對超聲提取黃酮類化合物有顯著影響，同時確定了提取條件的最佳工藝應為A3B2C2D3，即16倍量的80%乙醇超聲提取5次，每次提取30 min。與傳統的提取方法比較，發現超聲提取法明顯優于水煎煮法和回流提取法。水煎煮法和回流提取法需要加熱、費時，而超聲提取法操作簡單、省時，提取效率高。

［1］劉勇民，沙吾提·伊木克.維吾爾藥志(上冊)［M］.烏魯木齊:新疆科學技術衛生出版社，1999:119.

［2］中華人民共和國衛生部藥品標準維吾爾藥分冊［M］.烏魯木齊:新疆科學技術衛生出版社，1999:111.

［3］王薇，張長弓.蔥白總黃酮提取工藝的優化［J］.醫藥導報，2010，29(3):357－359.

［4］沈繼先，林筱琦，王春霞.維藥熱感顆粒提取工藝研究

［J］.醫藥導報，2009，28(10):1337－1338.