NF-κB抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸對順鉑腎毒性的影響

孫筱茹，張雅楠，陳一辰，齊 飛，羅 政，李茹男，郭連英，郝 冰，施廣霞

(1.大連醫科大學 2007級臨床醫學專業，遼寧 大連 116044；2.大連醫科大學 病理生理教研室，遼寧 大連 116044)

核因子κB(nuclear factorκB， NF-κB)，是1986年Sen和Baltimore首先發現并對其進行了描述，因其能與B細胞免疫球蛋白上的輕鏈基因增強子κB序列(GGGACT1TCC)特異結合而得名[1]。NF-κB近年來越來越受到人們的關注，它不僅通過調控細胞因子等的表達參與各種免疫、炎癥、應激性反應，還是細胞內重要的抗凋亡、促增殖的信號，NF-κB的組成性表達和異常活化是腫瘤化療耐藥的重要機制[2]， NF-κB抑制劑的抗腫瘤作用近年來已開始受到人們的重視并開發出多種小分子制劑[3]，吡咯烷二硫代氨基甲酸(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)是研究應用較多的一種。順鉑是常用的抗腫瘤藥物，用于治療肺癌、肝癌和卵巢癌等多種常見惡性腫瘤，但順鉑的全身毒性是不可忽視的，尤其是腎毒性和對造血功能的影響，臨床順鉑化療腎損害發生率為25%～35%[4]。本實驗使用NF-κB抑制劑PDTC與順鉑合用，觀察其對順鉑毒性作用的影響，以探討NF-κB在順鉑所致毒性中的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：SD大鼠60只(體重210～250 g)，由大連醫科大學實驗動物中心提供。

1.1.2 主要試劑和儀器：PDTC(25 mg/kg)、順鉑(10 mg /2 mL)(由山東多欣藥業有限公司提供)、0.9%生理鹽水、一氧化氮試劑盒、碘[125I]白細胞介素1放射免疫分析藥盒、碘[125I]腫瘤壞死因子-α放射免疫分析藥盒(均由北京普爾偉業生物科技有限公司提供)考馬斯亮藍、乙醇、96孔板、721分光光度計、勻漿器、離心機、水浴槽。

1.2 方 法

1.2.1 實驗分組及用藥：先取20只SD大鼠分別腹腔注射順鉑和順鉑+PDTC，觀察動物至死亡，以確定用藥劑量和動物模型終止時間。再取40只SD大鼠隨機分為4組，分別是空白對照組，PDTC組，順鉑組，PDTC及順鉑聯合用藥組，每組10只。腹腔注射，空白對照組(生理鹽水0.2 mL/d)，PDTC組(PDTC 25 mg/kg、0.1 mL/d，生理鹽水0.1 mL/d)，順鉑組(順鉑10 mg /2 mL 、0.1 mL/d，生理鹽水0.1 mL/d)，PDTC及順鉑聯合用藥組(PDTC 25 mg/kg、0.1 mL/d，順鉑10 mg /2 mL,0.1 mL/d)。

1.2.2 標本及指標的采集：對照組和PDTC組于實驗第13天、順鉑組和順鉑+PDTC組于用藥后第4天經大鼠尾取血，做白細胞計數。次日處死所有大鼠，大鼠內眥取血做血涂片、白細胞計數和分離血清，稱體重和腎重。取腎組織加入生理鹽水制備腎組織勻漿。

1.2.3 采用放射免疫分析測血清和腎組織勻漿中細胞因子TNF-α和IL-1的量，用生物化學方法測血清尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)含量。

1.3 統計學方法

2 結 果

2.1 腎系數(腎/體)各組間比較

實驗結果表明順鉑對大鼠有較大毒性，預實驗中10只大鼠于9 d內全部死亡，合用PDTC未延長大鼠的壽命，必須縮短觀察時間實驗才能進行。4組中應用順鉑的大鼠腎系數增高，為4.9440±0.5456，與對照組比較差異具有顯著性意義，P<0.05，PDTC組與對照組、PDTC聯合順鉑組與單用順鉑組比較腎系數的差異無顯著性意義，P>0.05。見表1。

表1 用藥后腎系數的變化

1)與對照組比較，P<0.05；2)與PDTC組比較，P<0.05

2.2 各組間外周血白細胞計數比較

注射順鉑的小鼠外周血白細胞數目降低至(3780±1760.713)個/mm3，與對照組比較差異有顯著性意義(P<0.05)，合用PDTC組外周血白細胞數略有增加，但與順鉑組比較差異無顯著性意義(P>0.05),見表2。

表2 用藥后外周血白細胞計數變化

1)與對照組比較，P<0.05；2)與PDTC組比較，P<0.05

2.3 大鼠血清和腎組織勻漿TNF-α、IL-1含量的變化

注射順鉑大鼠TNF-α順鉑組血清中TNF-α的含量低于對照組,應用順鉑后大鼠血清IL-1水平沒有明顯變化，腎組織勻漿IL-1含量明顯增加。聯合應用PDTC 后含量下降，與單用順鉑組比較差異具有顯著性意義(P<0.05)。

表3 用藥后大鼠血清和腎組織勻漿TNF-α、IL-1含量的變化

1) 與對照組比較，P<0.05；2)與PDTC組比較，P<0.05；3)與順鉑組比較，P<0.05

2.4 大鼠血清BUN、Cr含量

單用順鉑或合用PDTC的大鼠血清BUN及Cr較對照組均有明顯升高(P<0.05)，而兩組之間的差異無顯著性意義。見表4。

表4 大鼠血清BUN和Cr含量的變化

1)與對照組比較,P<0.05

3 討 論

PDTC有清除氧自由基的作用，Rangan等[5]最早應用于體內抑制大鼠腎小管內皮細胞NF-κB的激活，劑量達200 mg/kg，未發現明確的毒性作用。選擇抗氧化劑PDTC來抑制NF-κB的激活是依據：(1)許多已知的IκBα磷酸化誘導物可使活性氧產生增加。NF-κB抑制蛋白-IκBα的降解又是NF-κB活化的中心環節。(2) H2O2：可激活某些細胞中的NF-κB,活性氧是順鉑引起腎毒性的重要機制[6]。(3)TNF-α誘導的信號傳導可以產生活性氧介質(ROS)。PDTC對甘油所致腎損傷有保護作用[7]。本實驗結果表明順鉑對大鼠有很強的毒性，出現體重降低、腎臟腫大和血清BUN與Cr含量增高、外周血白細胞數目減少等。PDTC 本身不引起上述毒性反應，但本實驗條件下合用PDTC不能減輕上述毒性反應。

順鉑誘導的腎小管上皮細胞凋亡與死亡受體及配體有關,順鉑處理的大鼠腎小管上皮細胞Fas、Fas-L、TNF-α mRNA表達顯著增高[8]。現已有人觀察到順鉑腎損害過程中大量的炎性細胞因子、趨化因子的活化,并認為TNF-α可能是中心啟動環節。PDTC抑制NF-κB傳導通路的活化，即抑制了TNF-α基因位點的轉錄活性，減少致炎因子的基因表達與合成釋放,減少TNF-α的表達[7]。應用PDTC的正常大鼠腎組織勻漿中TNF-α含量降低。但與順鉑聯合用藥后不能降低腎組織勻漿TNF-α含量，順鉑處理的大鼠腎組織勻漿IL-1含量明顯升高，聯合PDTC可降低其含量。本實驗的結果說明PDTC本身無明顯毒性，能降低順鉑處理的大鼠腎組織勻漿中IL-1的含量，這些變化在順鉑腎毒性產生的機制與防治中的意義還有待進一步研究。

[1] Sen R,Baltimore D.Multiple nuclear factors interact with the immunoglobulin enhancer sequence[J].Cell,1986,46 (5):705-716.

[2] Saxaki N,Morisaki T,Hashizume K.Nuclear factor-κB p65 (RelA) transcription factor is constitutively activated in human gastric carcinoma tissue[J].Clin Cancer Res,2001,7(12):4136-4142.

[3] Gupta S,Sundaram C,Reuter S.Inhibiting NF-κB activation by small molecules as a therapeutic strategy[J].BBA-Gene Regul Mech,2010,1799: 775-787.

[4] Ramesh G,Reeves WB.Salicylate reduces cisplatin nephrotoxicity by inhibition of tumor necrosis factor-α[J].Kidney Int,2004,65(2): 490-498.

[5] Rangan GK,Wang Y,Tay YC,et al．Inhibition of nuclear factor-κB activation reduces cortical tubulointerstitial injury in protein uric rats[J]．Kidney Int，1999,56(1)：118-134.

[6] Rasoulian B,Jafari M,Mahbod M,et al.Pretreatment with oxygen protects rat kidney from cisplatin nephrotoxicity[J].Ren Fail,2010,32(2):234-242.

[7] Tamada S,Asai T,Kuwabara N,et al.Inhibition of nuclear factor- κB activation reduces glycerol-induced renal injury[J].J Nephrol,2006,19(4):439-448.

[8] Tsuruya K,Tokumoto M,Ninomiya T,et al.Direct involvement of the receptor-mediated apoptotic pathways in cisplatin-induced renal tubular cell death[J].Kidney Int,2003,63 (1):72-82.