早期胃癌的還氧合酶-2、抑癌基因P16和肝細胞生長因子表達

韓玉龍 ，孫 雷 ，尹家俊

(1.大連大學 附屬中山醫院 普外二科，遼寧 大連 116001；2.大連醫科大學 病理學教研室，遼寧 大連 116044)

胃癌是影響人類健康的常見的惡性腫瘤，其在消化系統惡性腫瘤中占第1位，每年死于胃癌者25.16/10萬。隨著環境、飲食等因素的變化，其發病率正逐年增高。胃癌的發生發展是一個多基因參與的多步驟的過程，與其他惡性腫瘤一樣，其發病機制尚不完全清楚。能夠找到在胃癌的發生發展中眾多基因相互作用的機制，一直是人們潛心研究的重要課題和努力方向。

還氧合酶(COX-2)、抑癌基因P16以及肝細胞生長因子(HGF)和胃癌的發生有一定的關系。但研究結論并不一致，而且有關早期胃癌中COX-2、P16 和HGF三者之間蛋白表達的相關性的研究至今未見報道。本研究試圖通過免疫組化方法檢測早期胃癌組織中COX-2、P16 和HGF蛋白表達，旨在探討三者之間的相關性及意義。

1 材料和方法

1.1 一般資料

隨機選取大連大學附屬中山醫院及大連市中心醫院2005～2007年間手術切除的早期胃癌30例。所有患者術前均未行放療及化療。同時，選擇同期10例不典型增生胃組織和10例正常胃組織作為對照。

1.2 試劑和方法

采用免疫組織化學SP法，COX-2一抗為鼠抗人單克隆抗體，購自福州邁新生物技術開發有限公司，P16一抗為鼠抗人單克隆抗體，購自北京中杉金橋生物技術有限公司，HGF一抗為兔抗人多克隆抗體，購自武漢博士德生物工程有限公司，均為即用型試劑，SP超敏試劑盒：內源性過氧化物酶阻斷劑、正常非免疫動物血清、生物素標記的第二抗體、鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶、DAB顯色試劑，均購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.3 結果判定

COX-2和HGF陽性染色者在細胞膜和細胞漿有棕黃色顆粒沉著，P16陽性染色者在細胞核或細胞漿有棕黃色顆粒沉著，兩位病理醫師獨立觀察每張切片隨機選區的10個高倍視野，采用雙評分半定量法，根據染色程度及染色細胞的百分率進行評分，基本不著色者為0分，著色淡者為1分，著色深者為2分；著色細胞占計數細胞百分率<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分。將每張切片著色程度得分與著色細胞百分率各自相乘，為其最后得分。0～1為陰性(-)，2～3為低度陽性(+)，4～5為中度陽性(++)，6以上為高度陽性(+++)。

1.4 統計學方法

3樣本各自在3種之間的比較，采用多組有序變量資料的秩和檢驗方法，P<0.05為差異有統計學意義，兩樣本間相關性分析，采用Kendall's tau-b 相關分析方法，當P<0.05、R接近+1或-1時表明有顯著的相關性。所有統計均由SPSS 11.5統計軟件包完成。

2 結 果

2.1 COX-2的表達情況

正常胃組織呈陰性表達；不典型增生胃組織陽性表達較多，且有3例強陽性表達，早期胃癌組織主要呈弱陽性至強陽性表達，主要位于腫瘤細胞的胞漿，在高倍鏡下呈棕黃色顆粒彌漫性的分布與癌細胞胞漿或沿核膜周邊呈線狀分布。由表1可見，正常胃組織→不典型增生胃組織→早期胃癌組織，COX-2呈上調趨勢。早期胃癌組織與正常胃組織比較、不典型增生胃組織與早期胃癌組織比較，差異具有顯著性意義(P<0.01)，而正常胃組織與不典型增生胃組織比較，差異無顯著性意義(P>0.05)。

2.2 P16的表達情況

在正常胃組織中，P16從不表達至強陽性，位于細胞核或細胞漿，也是呈現棕黃色顆粒彌漫性分布；在不典型增生胃組織中，呈不表達或弱陽性表達；在早期胃癌組織中，不表達和弱陽性表達率明顯升高，僅有2例強陽性表達。由表1可見，正常胃組織→不典型增生胃組織→早期胃癌組織，P16的表達呈下調趨勢。正常胃組織與不典型增生組織比較，差異無顯著性意義；不典型增生胃組織與早期胃癌組織比較、早期胃癌組織與正常胃組織比較，差異具有顯著性意義(P<0.01)。

2.3 HGF的表達情況

正常胃組織主要呈陰性表達，不典型增生胃組織呈陽性表達，且有2例強陽性表達；早期胃癌組織主要呈弱陽性至強陽性表達，僅有2例不表達。不典型增生胃組織和早期胃癌組織勻稱彌漫性分布于細胞的胞漿內，在高倍鏡下呈棕黃色顆粒。由表1可見，正常胃組織→不典型增生胃組織→早期胃癌組織，HGF的表達呈上調趨勢。正常胃組織與不典型增生組織比較、不典型增生胃組織與早期胃癌組織比較、早期胃癌組織與正常胃組織比較，差異都具有顯著性意義。

2.4 COX-2、P16和HGF三者之間蛋白表達的相關性

通過相關性統計分析，在早期胃癌組織中， HGF與COX-2的表達呈正相關(r=0.628,P<0.01)，HGF 與P16的表達呈負相關(r=-0.490,P<0.01)。

表1 COX-2、P16、HGF在早期胃癌組織、不典型增生胃組織和正常胃組織中的表達差異性的比較

COX-2：不典型增生胃組織比胃癌組織，P<0.01；胃癌組織比正常胃組織，P<0.01；P16：不典型增生胃組織比胃癌組織，P<0.01；胃癌組織比正常胃組織，P<0.01；HGF：正常胃組織比不典型增生組織，P<0.05；不典型增生胃組織比胃癌組織，P<0.01；胃癌組織比正常胃組織，P<0.01

3 討 論

環氧合酶(cyclooxygenase，COX)是花生四烯酸合成前列腺素(prostaglangins,PG)過程中的一個限速酶，目前已知 COX 至少有兩種同種異構體，結構型 COX-1 和誘導型 COX-2。COX-2在多種腫瘤尤其是消化系統腫瘤組織及其相應的腫瘤細胞株中表達上調[1]。本研究結果，COX-2在正常胃組織至早期胃癌組織的表達呈上調趨勢，該結果和Sun等[2]的報道相一致，提示COX-2基因的激活可能是胃癌發生發展的重要因素，而正常胃組織與不典型增生胃組織相比，COX-2表達差異無顯著性意義，結果與張合喜等[3]的報道一致，但確切原因尚未知。

P16 基因位于人類第 9 號染色體短臂 2 區 1 帶(9p21)。人類 75%的癌細胞株有 p16 基因的缺失或突變。有研究報道在 p16 蛋白缺乏時腫瘤細胞的持續增殖能力可明顯提高[4],證明了 P16 蛋白是一種抑癌蛋白。本研究結果顯示，P16在正常胃組織至早期胃癌組織的表達呈下調趨勢,P16基因的失活可能是胃癌發生發展的重要因素。其失活機制可能為：①基因缺失或突變:包括純合缺失、雜合缺失、基因內堿基缺失、點突變。②甲基化:p16基因突變和缺失具有腫瘤類型的傾向性,但在某些腫瘤中其突變和缺失較少見[5]。

HGF是一異二聚體,HGF蛋白分子由A鏈和B鏈通過二硫鍵相連接,由728個氨基酸組成,HGF現在已被認為是一種具有多種功能的細胞因子[6]，原癌基因c-Met編碼產物是HGF的受體,因此HGF的受體也稱為c-Met受體[7]。本研究發現，HGF在正常胃組織至胃癌組織的表達呈上調趨勢。結果與Kermorgant S[8]報道一致，提示HGF蛋白表達與胃癌的發生發展有關。其可能的機制如下：HGF生物學活性是由原癌基因c-Met編碼的跨膜受體蛋白所介導[7],構成HGF-c-Met通路。HGF-c-Met通路的激活對促進腫瘤細胞的增殖、分化，在其生長、侵襲過程中發揮重要作用。

本研究發現，在早期胃癌組織中，HGF蛋白表達隨COX-2蛋白表達的增高而上調，具有明顯的正相關性。說明HGF可能通過COX-2的相關調節途徑對胃癌的發生發展起一定作用。其可能的機制是：①腫瘤細胞產生大量的前列腺素E2，作用于基質成纖維細胞，使成纖維細胞生成大量的HGF，而COX-2 是前列腺素合成的限速酶[9]；②HGF能顯著的誘導COX-2蛋白的表達和前列腺素的釋放[10]。 ③HGF-c-Met信號通路可能通過細胞外信號調節激酶的激活作用所介導，上調COX-2及增加胃癌中前列腺素E-2(PGE-2)的生成[11]。

本研究結果顯示,在不典型增生胃組織到早期胃癌組織中，HGF的表達呈上調趨勢而P16呈下調趨勢。此途徑可能與P16對細胞周期的調控有關。真核細胞分裂必須通過 G1期→S期的轉換開始進行 DNA合成,通過G2期→M期轉換進入有絲分裂期,在這些轉換過程中,CDK起著重要作用，CDK通過調節底物Rb蛋白的磷酸化而促使G1→S和G2→M期的轉換,導致細胞增殖。P16蛋白與cyclinD 競爭結合 CDK4,能夠特異性抑制 CDK4 的活性從而阻止細胞從G1期進入S期,抑制細胞增殖;相反cyclinD與CDK4結合時,刺激細胞生長、分裂,當p16基因由于缺失或突變不能表達時,cyclinD與CDK4的結合占優勢,過度刺激細胞分裂,使細胞呈失控性生長而形成腫瘤[12]。

本研究結果提示，COX-2、P16和HGF與胃癌的發生發展有關。HGF可能通過調節COX-2和P16的相關途徑在胃癌的發生發展起到一定的作用。但COX-2、P16和HGF是否通過同一條信號途徑在胃癌的發生發展中起作用的機制尚不十分清楚，有待于進一步研究。

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