中性粒細胞在實驗性小鼠腎毒性損傷中的變化及其意義

李傳剛，高華琨，孫章萍，羅世華，楊 明，郝偉瑩，戚 婷，胡 云，李媛媛，舒曉宏，李墨林

(1.大連醫科大學 附屬第二醫院 泌尿外科,遼寧 大連 116027； 2.大連醫科大學 臨床醫學08級學生，遼寧 大連 116044；3.大連醫科大學 藥物化學教研室，遼寧 大連 116044； 4.大連醫科大學 病理生理學教研室，遼寧 大連 116044)

順鉑(cisplatin，DDP)是臨床常用的治療實體腫瘤最有效的藥物之一,但DDP劑量依賴性的腎毒性作用極大限制了其療效的發揮。研究表明，DDP腎毒性的主要靶位是腎小管上皮，特別是近曲小管直部上皮細胞[1]，引起損傷局部缺血、缺氧、甚至灶狀壞死。DDP腎毒性損傷的發生機制尚未完全闡明,目前認為可能與氧化應激損傷有關[2,3]。由于吡咯烷二硫氨基甲酸(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)具有與金屬螯合的特性，可清除脂質過氧化代謝中間產物以及抑制組織細胞中核轉錄因子NF-κB的激活及核移位，從而發揮抗炎性和抗氧化效應[4]。因此，本課題前期研究將PDTC用于DDP腎毒性損傷的防治。結果發現，50 mg/kg PDTC能有效預防大劑量DDP所致的腎毒性損傷[5]，提示大劑量DDP所致的腎損傷可能不但與氧化應激損傷有關，也可能與炎癥有關。同時，Faubel S[6]研究發現DDP所致腎毒性損傷的腎組織中IL-1β、IL-18和IL-6含量增高，并有中性粒細胞浸潤，但中性粒細胞(polymorphonuclear neutrophil,PMN)在DDP所致腎損傷中作用至今尚不清楚。本研究在既往研究的基礎上，進一步探索PMN激活在大劑量DDP腎毒性損傷中的作用，為深入研究DDP腎毒性損傷的機制及其防治奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 主要藥品與試劑

注射用順鉑系江蘇豪森藥業股份有限公司產品(30 mg/6 mL),產品批號:091101。髓過氧化物酶(MPO)試劑盒系南京建成生物制品研究所產品。

1.2 動物與處理

昆明種小鼠40只，雌雄各半，體質量為28～33 g，平均(31.71±1.82)g，由大連醫科大學實驗動物中心提供。飼養于室溫16～28℃，相對濕度40%～70%環境中，自由飲水和進食。經適應性喂養后，依體重隨機分為4組：DDP用藥6 、24、48 h組和生理鹽水(NS)對照組，每組10只小鼠，性別和周齡相匹配。DDP針劑用生理鹽水配成1 mg/mL溶液，DDP用藥組小鼠腹腔注射DDP 0.12 mL/10 g體重，對照組小鼠腹腔內注射等量NS。分別取對照組和DDP用藥后6、24、48 h組的小鼠，稱重后乙醚麻醉，內眥靜脈取血、肝素抗凝，全自動血細胞儀進行白細胞(WBC)計數及分類，生化法檢測血尿素氮和肌酐含量。隨后，剖腹取小鼠兩側腎臟，制備10%腎皮質勻漿，比色法測定血漿和腎組織勻漿中MPO的含量。

1.3 標本的制備

1.3.1 血漿的制備：小鼠乙醚麻醉后，內眥靜脈取血、肝素抗凝，全血，靜置后離心3000 r/min,10 min，血漿置4℃冰箱備用。

1.3.2 腎皮質組織勻漿的制備：剖腹后迅速取出兩側腎臟，切下腎皮質部分，每0.1 g 腎皮質組織加入0.9 mL NS置玻璃勻漿器中反復研磨,制成10%的腎皮質勻漿，離心3000 r/min，10 min，上清置4℃冰箱內備用。

1.4 檢測指標

1.4.1 外周血WBC和PMN計數：分別取對照組和DDP用藥后6、24、48 h的小鼠，乙醚吸入麻醉后內眥靜脈取血、肝素抗凝，取少量抗凝血與等量肝素混合后全自動血細胞儀進行WBC胞計數和分類的檢測，了解DDP用藥前、后小鼠外周血WBC和PMN計數的變化。

血漿尿素氮(BUN)含量的測定:采用二乙酰一肟顯色法。分別將血漿、水或BUN標準應用液(含0.005 mg氮/mL)與二乙酰-肟-氨硫脲(DAM- TSC液)及二酸(濃磷酸和濃硫酸)混合液混合后，置沸水中煮沸10 min，流水冷卻3 min，520 nm 波長比色，以空白管調零,測各管的光密度值(A值)。利用下公式計算待測管血漿BUN含量(mmol/L)。

0.357×0.002×100/0.02

1.4.3 血漿肌酐(CRE)含量的測定:采用苦味酸沉淀蛋白法。 分別將血漿、水或肌酐標準應用液(0.05 mg/dL)與堿性苦味酸混勻后，置37°C水浴30 min，510 nm波長比色，以空白管調零，讀各管的A值，然后各管再加50%乙酸溶液兩滴，放置6 min后，再測各管的A值(A值’)。利用下公式計算待測管血肌酐含量(μmol/L)。

88.4×0.01/0.2×100

1.4.4 腎皮質勻漿組織蛋白含量:采用考馬斯亮藍G-250染色法測定蛋白質含量,蛋白標準液采用牛血清白蛋白(1 mg/mL)。取1 mg/mL的標準蛋白質溶液倍比稀釋，比色法測A595 值并繪制蛋白標準曲線；然后取10%腎皮質勻漿樣品，比色法測A595 值，從標準曲線上查出其相應的蛋白質含量。

1.4.5 血漿和腎組織MPO含量的檢測：比色法檢測，采用南京建成生物工程研究所生產的MPO試劑盒，按說明書要求進行測定。

1.5 統計學方法

2 結 果

2.1 DDP用藥后外周血WBC數量及分類的變化

DDP用藥后小鼠外周血WBC計數進行性下降，DDP用藥后48 h，小鼠外周血WBC計數下降至(3.7±0.66)×109/L，與對照組小鼠(5.93±0.55)×109/L比較，差異具有顯著性意義(P<0.01)。DDP用藥后24 h內，DDP用藥組小鼠外周血涂片可見中性粒細胞脫顆?，F象，無法進行WBC分類；DDP用藥后48 h，外周血涂片未見明顯的中性粒細胞脫顆?，F象，此時，DDP用藥組小鼠PMN計數為(1.47±0.99) ×109/L，與對照組(1.44±0.84) ×109/L比較,差異無顯著性意義(P>0.05)。

2.2 DDP用藥后小鼠腎功能的變化

由表1可見，小鼠血BUN含量在DDP用藥24 h后進行性升高,與對照組小鼠比較差異具有顯著性意義(P<0.01)；而小鼠血CRE含量較對照組小鼠增高出現在DDP用藥后48 h(P<0.01)。

表1 DDP用藥后小鼠腎功能的變化

1)與對照組相比，P<0.01

2.3 外周血MPO含量的變化

DDP用藥后小鼠外周血MPO含量的變化見圖1。由圖1可見，DDP用藥后24 h內，小鼠外周血MPO含量較對照組略有降低，但差異無顯著性意義(P>0.05)；DDP用藥后48 h，小鼠血漿MPO含量升高達(39.58±4.04)U/L，與對照組(19.44±5.87)U/L比較，差異具有顯著性意義(P<0.01)。

2.4 腎皮質勻漿組織蛋白含量

大劑量DDP用藥后6、24、48h腎皮質勻漿中組織蛋白的含量分別為(9.35±1.67)、(10.58±0.94)、(8.63±2.78) mg/mL，與對照組腎皮質勻漿中組織蛋白(9.67±1.99)mg/mL比較，差異無顯著性意義(P>0.05)。

圖1 DDP用藥后小鼠外周血MPO含量的變化

2.5 DDP用藥后腎皮質勻漿MPO含量的變化

由圖2可見，大劑量DDP用藥后6 h，腎皮質勻漿中MPO含量為(0.29±0.08)U/g，DDP用藥后24 h腎皮質勻漿中MPO含量升至(0.34±0.11)U/g，與對照組小鼠(0.13±0.03)U/g比較，差異具有顯著性意義(P<0.01)；但DDP用藥后48 h，腎皮質勻漿MPO含量降至(0.16±0.02)U/g，與對照組差異無顯著性意義(P>0.05)。

圖2 DDP用藥后小鼠腎組織MPO含量的變化

3 討 論

急性腎功能衰竭是腎臟本身或腎外原因引起腎臟泌尿功能急劇降低,以致機體內環境出現嚴重紊亂的臨床綜合征，是臨床常見的危重病理生理過程。目前臨床多采用水化利尿的方法來減少DDP腎毒性的發生，但統計顯示，臨床順鉑(DDP)化療腎損害發生率仍高達25%～35%[7]，提示DDP腎毒性損傷的機制仍有待于進一步探索。

中性粒細胞(neutrophil)是體內數量最多的炎性細胞,來源于骨髓，釋放后在血流中僅數小時便移出血管，具有很強的趨化、變形、粘附、吞噬和殺菌作用,在機體抗感染的病理過程中起非常重要的作用[8]。正常情況下，循環中的PMN處于非活化狀態，必須在化學趨化因子或激活劑作用下粘附于內皮細胞表面活化，趨化PMN的化學因子有兩類：一類是自身組織損傷釋放的因子，如膠原和纖維蛋白片段、補體活化產物及免疫細胞因子等；另一類是微生物來源的含有N-早酰蛋氨酸殘基的多肽。受趨化因子作用后，PMN表面的L-選擇素(selectin)數量增加，血管內皮細胞開始表達P-或E-選擇素，這兩類選擇素結合啟動了PMN與內皮細胞粘附。隨后，PMN迅速表達整合素(intergrin)，例如MAC-1和LFA-1等，與內皮細胞的配體結合可使PMN變扁，緊密粘貼內皮細胞。繼而，PMN變形移出血管外向炎性或受損組織中浸潤，活化的PMN脫顆?；蛲ㄟ^呼吸爆發生成大量的活性氧(reactive oxygen species,ROS) 和其他炎癥介質,參與機體對病原微生物的殺滅和清除，甚至引起組織損傷。目前研究表明，PMN產生ROS 的過程主要依賴于還原型輔酶Ⅱ(NADPH)、MPO氧化酶系統。其中，MPO 是PMN嗜天青顆粒釋放的過氧化物酶類,是PMN聚集的特征酶,是PMN脫顆粒的標志，其主要催化H2O2與Cl-起化學反應,產生次氯酸,后者具有很強的抗微生物活性[9]。Bradley 等[10]研究表明,MPO 的表達水平與PMN計數之間存在極顯著相關性,并可作為PMN的功能標志。

本研究利用單一劑量DDP(12 mg/Kg)腹腔內注射制備小鼠急性腎損傷的動物模型[5]，結果發現DDP用藥后48 h小鼠血BUN和CRE含量明顯增高，與對照組小鼠比較差異具有顯著性意義(P<0.01)，提示DDP用藥后48 h小鼠出現急性腎功能衰竭。

通過檢測大劑量DDP用藥后48 h 內小鼠外周血WBC、PMN計數和PMN釋放的MPO含量，結果發現：DDP用藥后24 h內，伴隨外周血WBC計數的降低，血MPO含量也逐漸下降，外周血WBC計數的下降與血MPO含量的降低相一致；同時，小鼠外周血涂片檢查發現：DDP用藥后24 h內小鼠外周血存在中性粒細脫顆?，F象。DDP用藥后48 h，DDP用藥組小鼠外周血WBC計數繼續下降，與對照組比較差異有顯著性意義(P<0.01)，但小鼠外周血涂片檢查未見明顯的PMN脫顆?，F象，兩組小鼠外周血PMN計數比較差異卻無顯著性意義(P>0.05)；此時，DDP用藥組小鼠血MPO含量明顯高于對照組小鼠，差異均具有顯著性意義(P<0.01)。由于MPO存在于PMN的嗜天青顆粒中，PMN激活時可釋放MPO，從而使外周血MPO含量增加。本研究發現，DDP用藥組小鼠外周血MPO活性升高出現的時間與大劑量DDP用藥后小鼠急性腎功能衰竭出現的時間相吻合，提示大劑量DDP所致小鼠腎損害可能與PMN激活、大量釋放MPO有關。通過檢測10%腎皮質勻漿中的MPO含量，研究結果發現：DDP用藥后6 h 小鼠腎皮質勻漿MPO含量明顯升高，DDP用藥后24 h 達高峰，為(0.34±0.11)U/g，與對照組小鼠(0.13±0.03)U/g 比較，差異具有顯著性意義(P<0.01)；DDP用藥后48 h腎皮質勻漿MPO含量下降，與對照組比較差異無顯著性意義(P>0.05)。大劑量DDP用藥后24 h內腎皮質勻漿MPO活性增高,提示大劑量DDP所致小鼠腎毒性損害早期，小鼠腎組織內存在PMN活化、脫顆粒并釋放MPO。由于MPO可將H2O2與Cl-轉為次氯酸,而次氯酸是強氧化劑，可氧化巰基，使氨基酸和蛋白質降解，從而造成腎組織細胞損傷。因此，DDP所致的急性腎損害可能與PMN釋放髓過氧化物酶有關。

綜上所述，大劑量DDP用藥后24 h內小鼠外周血WBC數量明顯下降。但外周血涂片可見PMN脫顆粒、腎皮質勻漿中MPO含量明顯升高，考慮可能與DDP用藥后PMN活化、聚集至腎臟、并大量釋放MPO，引起腎損傷，最終導致小鼠出現急性腎功能衰竭。因此，大劑量DDP所致小鼠腎損害與PMN在腎皮質內的激活、釋放有關，研究并開發抑制PMN活化的方法和措施，應有助于DDP腎損傷的防治。

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