肝細胞生長因子對面神經損傷模型大鼠面肌TGF-β表達的影響

劉燁 駱文龍 陳利濤

面神經周圍段由于其位置表淺，外傷、炎癥、手術和腫瘤等易造成其損傷，而目前面神經損傷后的治療仍是臨床醫學中所面臨的難點問題之一。大多數學者認為面神經損傷后修復的難點主要有以下兩點[1]：一是如何防止面神經損傷后的神經元死亡，即如何替代已經死亡的神經細胞；二是如何抑制面神經損傷后失神經支配的骨骼肌纖維化，從而有利于神經軸突再生及其收縮功能的恢復。前者目前最理想的方法只有通過干細胞移植，然而很難用于臨床；后者則通過抑制面神經損傷后面頰肌的纖維化來實現，相對于前者可行性更高。文獻報道[2]肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)通過促進上皮細胞增殖、抑制上皮細胞凋亡及促進膠原降解、抑制膠原合成，參與肝、腎、心、肺等多種器官的結構重建，起器官保護作用，是少數能夠阻止器官纖維化的生長因子之一。既往研究[3，4]從形態學、神經電生理方面證實外源性的HGF(10 μl)對面神經損傷后神經干、神經元、肌運動終板都有保護作用。Yuichi等[5]從功能上和組織學上觀察到轉基因的HGF能促進撕脫傷后的運動神經元恢復。本實驗通過建立面神經鉗夾傷模型，利用免疫組化及Western blot技術，研究HGF對面神經損傷后面頰肌轉化生長因子-β(TGF-β，最強的促膠原生成因子)的影響，探討HGF是否能通過抑制面頰肌的纖維化來實現其對神經損傷的保護作用及其具體機制。

1 材料與方法

1.1試劑與設備 玻璃勻漿器(寧波新芝DY89-1)、高速離心機(湖南湘儀H1650-W)、分光光度儀(上海欣茂UV-7504)、垂直板電泳轉移裝置(上海天能生物)、電泳儀(北京君意JY300C)、多用脫色搖床(蘇州捷美SYC-2101)，單去污劑裂解液(北京普利萊生物)、0.01 mol/L PBS (pH 7.3)、10%分離膠、4%濃縮膠、0.15 mol/L NaCl 溶液、5XSDS 上樣緩沖液、電泳緩沖液、轉移緩沖液、封閉液、TBST、TBS、顯影液、定影液、抗體、化學發光試劑，鼠抗-TGF-β(購于上海sigma公司)二抗試劑盒(購自Dako公司)，重組人類肝細胞生長因子1mg(購于百萃生物科技有限公司)。

1.2動物分組及實驗方法 30只SD大鼠(體重220～280 g)購于重慶醫科大學動物實驗中心，飼養于12小時光照/12小時黑暗的環境，自由進食。隨機分成三組：對照組、生理鹽水組和HGF組，每組10只。

1.2.1面神經鉗夾傷模型的建立[6]及治療 三組動物分別制作右側面神經鉗夾傷模型，動物以10%水合氯醛腹腔注射(3 ml/kg)麻醉后，切開皮膚、皮下組織，仔細分離右側面神經頰支，用顯微外科鑷鉗夾其近心端(以鑷子第一扣為準，均為同一實驗者操作)10秒鐘后，HGF組和生理鹽水組分別在面神鉗夾處周圍填入浸滿HGF或生理鹽水10 μl的醫用膠原蛋白海綿塊，然后逐層縫合，術后連續3天腹腔注射青霉素預防感染，對照組不做任何治療。連續觀察大鼠胡須的運動方向1個星期(初步判斷面神經的損傷程度)。1月后(既往研究證實面神經損傷后1月左右面頰肌纖維化最明顯)[3,4]取右側面頰肌，行免疫組化染色及Western blot實驗檢測TGF-β的表達。

1.2.2免疫組化方法 10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，迅速取完整大鼠面頰肌，稱重后放入多聚甲醛4 ℃冰箱保存24小時，常規脫水、包埋、切片。免疫組化染色步驟為：①常規脫蠟，梯度酒精脫水；②過氧化氫消除內源性過氧化物酶的活性；③抗原修復；④抗原封閉；⑤加適當稀釋一抗(50 μl)；⑥滴加二抗；⑦滴加HPR液；⑧滴加DAB顯色液、復染、封片，各步驟之間用0．01 mol/L PBS充分洗滌；⑨復染，每只大鼠在相似層面各取1～3張片子，利用顯微圖像分析系統，在200倍物鏡下，對面頰肌TGF-β表達平均光密度進行計算分析(陽性產物為棕黃色或棕褐色，背景為藍色)。

1.2.3Western blot實驗 按照蛋白提取液說明書提取蛋白。取適量蛋白質經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后轉到PVDF膜上，轉膜后在5%的脫脂牛奶中進行封閉，然后加鼠抗-TGF-β(1：3 000)，溫育1.5小時。用TBST清洗3次，每次5分鐘，用封閉液將二抗稀釋成一定的濃度(1:5 000)，溫育1.5小時，用TBST清洗4次，每次5分鐘。化學發光，顯影，定影，對膠片進行掃描，最后用UVP凝膠圖像處理系統Labworks4.6軟件分析目的條帶的灰度值，實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1面神經鉗夾傷后HGF對面頰肌濕重的影響 對照組面頰肌濕重為1.954±0.119 g，與生理鹽水組(1.952±0.104 g)比較差異無統計學意義(P>0.05)),HGF組面頰肌濕重為1.791±0.095 g，與前兩組比較差異有統計學意義(P<0.01)。

2.2HGF對面頰肌TGF-β表達的影響 HGF組面頰肌肌纖維比較清晰，TGF-β有散在表達，而對照組、生理鹽水組面頰肌肌纖維排列較雜亂，TGF-β表達聚集(圖1)。HGF組TGF-β免疫化學累計光密度明顯低于對照組及生理鹽水組(P<0.01)，而對照組與生理鹽水組之間差異無統計學意義(P>0.05)(表1)。

表1 三組TGF-β免疫化學累積光密度

注：與其他兩組比較，P<0.01

2.3Western blot檢測TGF-β蛋白表達結果 West blot檢測發現，HGF可抑制TGF-β蛋白的表達，生理鹽水對TGF-β無明顯影響(圖2)。用Labworks4.6軟件分析TGF-β蛋白的相對表達率，對照組、生理鹽水組、HGF組TGF-β蛋白的相對表達率分別為36.4%±4.4%、36.7%±3.8%、15.1%±2.9%，HGF組較對照組及生理組TGF-β蛋白表達明顯減少(P<0.01)，而生理鹽水與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

圖1 三組動物面頰肌 TGF-β表達情況 a 對照組；b 生理鹽水組;c HGF組。箭頭所示為TGF-β陽性表達(SP×200)

圖2 Western blot檢測三組面頰肌TGF-β蛋白的表達

3 討論

HGF屬于纖溶酶原依賴的生長因子家族，是一種可溶性的細胞因子，最初認為它僅能刺激肝細胞增生，現已被證實其具有多種功能，在全身多處均有表達，它不僅是神經外組織細胞的分裂原、運動因子、成型索，而且還對大腦及外周神經系統的發育和維持、軸突靶向分布以及軸突生長有一定作用。HGF可以通過自分泌、旁分泌以及經典的軸突逆向運輸的方式保護神經元和軸突再生，促進雪旺細胞的分裂，抑制纖維瘢痕的生長[7]。神經損傷后HGF在中樞分泌較少，而在靶組織大量增加，故在外周神經損傷時，局部應用HGF更有意義[8]。哈小琴等[9]報道局部應用HGF可促進皮膚愈合，還可促進皮膚中附屬器的形成，故本實驗采用局部應用HGF觀察其對面神經損傷后修復的影響。

目前研究[10]認為TGF-β是最強的促膠原生成因子，與心、肝、腎纖維化進程密切相關，其作用表現在活化的TGF-β能使腎小管上皮細胞、肝星狀細胞和心肌細胞分化為成纖維細胞，促進其生成大量纖維蛋白和I型、Ⅲ型膠原蛋白，同時抑制膠原酶釋放，阻滯基質蛋白降解，使細胞外基質合成與降解失衡，最終發生心、肝、腎等器官纖維化。任國山等[11]研究表明，HGF對新生大鼠受損的面運動神經元有保護作用。 Mou等[12]發現HGF通過減少腎臟TGF-β的表達來抑制腎臟的纖維化。大量的實驗證實[13～15]在心臟、肺、肝臟，HGF同樣通過抑制TGF-β的表達減少器官的纖維化，從而促進器官的功能修復。本實驗在大鼠面神經損傷后局部使用HGF同樣是擬通過抑制面頰肌的纖維化來促進神經損傷的修復。

本實驗在大鼠面神經鉗夾傷后局部應用HGF，通過比較三組面頰肌濕重、免疫組織化學染色和Western blot檢測結果發現，HGF組TGF-β蛋白表達較對照組及生理鹽水組明顯減少，可見，HGF可通過減少失神經支配后面頰肌TGF-β的表達來抑制面頰肌的纖維化，從而促進面神經損傷后的修復，這對臨床上局部應用HGF治療各種面神經損傷具有重要意義，但HGF對TGF-β整個信號通路存在何種影響以及HGF是否還通過減弱其它膠原生成因子的表達來促進神經損傷后的修復，有待進一步研究。

(致謝：衷心感謝重慶醫科大學附動物實驗中心的全體老師在實驗中給予的無私幫助！)

4 參考文獻

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12 Mou S，Wang Q, Shi B, et al.Hepatocyte growth factor suppresses transforming growth factor-beta-1 and type III collagen in human primary renal fibroblasts[J] .The Kaohsiung Journal of Medical Sciences, 2009,25:577.

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